四川大学のRong Xin氏のチーム：骨再生のための3Dプリント多孔質ナノファイバー足場

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

天然の骨組織には、自己再生および修復する固有の能力があります。しかし、外傷、腫瘍、感染症などさまざまな原因による大規模な骨欠損の再生は、内因性の再生メカニズムでは組織の完全性を回復できないことが多いため、依然として重大な課題となっています。この根強い臨床上のジレンマは、革新的なアプローチの必要性を浮き彫りにしています。複雑な形状をカスタマイズできることで知られる 3D プリントは、組織再生におけるパラダイムシフトです。大規模で複雑な組織構造を忠実に複製することで、従来の生物学的足場に比べて大きな利点があります。したがって、3D プリンティングは、組織源、免疫拒絶、および病気の伝染に関連する問題を含む、従来の骨移植のリスクを軽減するための有望な手段を提供します。現在の 3D 印刷技術では、骨再生を促進するために天然の骨細胞外マトリックス (ECM) を模倣するように設計されたナノファイバー構造を持つ階層型 3D スキャフォールドを製造する上で大きな制限があります。

四川大学のRong Xinチームは、生分解性ナノファイバーマイクロスフィアをバイオインクとして使用し、3Dプリントによってナノファイバー構造を持つ階層的多孔質足場をカスタマイズする革新的な方法を提案しました。試験管内研究では、階層的な多孔質構造によって細胞の浸潤と増殖率が大幅に向上し、ナノファイバーのトポロジーによって骨形成の分化と ECM の沈着を誘導する物理的な手がかりが得られることが実証されました。 3D プリントされたナノファイバースキャフォールドを細胞キャリアとして使用すると、生体内での骨組織の再生と統合が促進されました。さらに、容易で多用途な化学修飾により、足場機能の正確なカスタマイズが可能になります。この汎用 3D 印刷方法の基本コンポーネントとして、高度な生体模倣性と多機能修飾特性を備えたナノファイバーマイクロスフィアを使用することで、マクロ的な外部形態から分子レベルの生化学的ダイナミクスに至るまで、スキャフォールドの生物学的特性を完全に操作して、多様な臨床ニーズに対応します。関連研究は、2024年11月16日に「骨再生のための3Dプリント階層的多孔質ナノファイバー足場」というタイトルの記事でSmall誌に掲載されました。

【GelMAナノファイバーマイクロスフィア（GMNF-MS）の調製と特性評価】

GMNF-MSは、マイクロ流体技術と熱誘起相分離（TIPS）技術を組み合わせて合成されました（図1A）。調製プロセスでは、GelMA 溶液を分散相として、鉱油を連続相として使用して球状の GelMA 液滴を生成し、その後 TIPS 技術で処理して GMNF-MS を形成しました。これらの GMNF-MS は狭いサイズ分布を示します。 GMNS-MSのサイズは、連続相（GelMA溶液）と分散相（鉱油）の流量比を調整することで調整できます（図1B～F）。本研究では、直径250µmのマイクロ流体チップを使用し、GelMA溶液の流量は0.1mL/hであった。鉱油の流量が4mL/hから1mL/hに減少したとき、GMNS-MSの直径はそれぞれ55～58µmと221～223µmでした（図1B～D）。 GMNS-MSの直径は、線形方程式Y = −2148.7X + 267.85に適合します。ここで、XはGelMA溶液/ミネラルオイルの流量比です（図1F）。
図1 GelMAナノファイバーマイクロスフェア（GMNF-MS）の調製の概略図
GMNF-MS のナノ構造と多孔性は、GelMA 濃度を変化させることによって調整されました。 GelMAの濃度が増加するにつれて、ナノファイバー構造と多孔質特性が徐々に弱くなることが観察されました（図2A〜E）。 GelMA 濃度が 8% から 16% に増加すると、ナノファイバーの平均長さは 776 ± 175 nm から 296 ± 71 nm に減少し、ナノファイバーの直径は増加しました。特に、GelMA濃度が20％になると、ナノファイバーは太くなり、凝集しました（図2D）。したがって、GelMA濃度が8％から24％に増加すると、GMNF-MSの多孔性は96％から83％に減少しました（図2F）。一方、GMNF-MSの見かけ密度と弾性率はそれぞれ3倍と12.5倍に増加した（図2G、H）。さらに、GMNF-MSの分解速度はGelMA濃度の増加とともに低下しました（図2I）。 GelMA 濃度が高くなると、GMNF-MS の多孔性と比表面積が減少し、ゼラチナーゼの攻撃ポイントが減少し、分解速度が遅くなります。 GMNF-MS の異なる濃度は、30 分以内に約 15 倍の同様の平衡膨潤率を示し、GelMA 濃度が膨潤平衡にほとんど影響を与えないことを示しています (図 2J)。 12% GelMA を使用して調製された GMNS-MS は最適化されたナノファイバー構造と物理的特性を持っていたため、これらのマイクロスフェアがその後の実験に選択されました。

図2 GMNF-MSの特性
[3Dプリント階層型多孔質GelMAナノファイバーマイクロスフィアスキャフォールド（HP-GNMS）とGelMAハイドロゲルスキャフォールド（GHS）]
HP-GNMSを印刷するために、PF-127がサポートおよび犠牲インクとして使用されました。これは、優れたレオロジー特性を持ち、穏やかな条件下で簡単に印刷および除去できるためです（図3A）。注目すべきは、30% (w/v) PF-127 は 22°C で弾性率が約 0.84 × 104 Pa のゲル状態を示し、4°C 未満では液体状態に変化するということです。この相変化により、3D プリントされた 2 相スキャフォールドから犠牲インクを除去するプロセスが簡素化されます。さらに、マイクロスフィアは4℃で高速遠心分離によって液体PF-127インクに組み込まれ、3Dプリント用の高密度に詰まったマイクロスフィアが形成されました（図3A）。高密度に詰め込まれたマイクロスフィアにより、バイオインクのレオロジー特性が大幅に向上しました。注目すべきは、印刷温度 22 °C では、密集したマイクロスフィアを含むバイオインクの弾性率 (2.5 × 104 Pa) が、純粋な PF-127 (0.84 × 104 Pa) や PF-127 にマイクロスフィアが均一に分散したバイオインク (1.7 × 104 Pa) の弾性率よりも大幅に高いことです。さらに、高密度に充填されたマイクロスフィアの条件下では、22℃で異なる濃度のGelMA（8％、12％、16％、20％、24％）を含むマイクロスフィアで作られたバイオインクの弾性率に有意な差はありませんでした。これは、マイクロスフィアの GelMA 濃度が、高密度に充填されたマイクロスフィアバイオインクのレオロジー特性と印刷性にほとんど影響を与えないことを示しています。

22°C で形成された Pluronic 127 インクは、強力なせん断減粘挙動を示す二次ポリマーネットワークを形成し、3D 印刷プロセス中の効率的な押し出しと急速な安定化を保証することがわかりました (図 3A)。 PF-127 のユニークなレオロジー特性は、印刷プロセス全体を通じて高密度に充填されたマイクロスフェアの安定性を維持する上で重要な役割を果たしました (図 3B、C)。さらに、PF-127 の高粘度により、空気圧押し出し中に積層されたマイクロスフェアがわずかに変形し、界面接触面積が増加し、光架橋中に HP-GNMS の安定した共有結合の形成が促進されました (図 3E–H)。架橋およびPF-127の除去後、高密度に充填されたマイクロスフェアは球形を維持した（図3D）。最終的なHP-GNMSでは、突出した繊維の明らかな崩壊や歪みは見られませんでした（図3D、E）。図 3G、H に示すように、各マイクロスフェアは隣接するマイクロスフェアと相互接続され、HP-GNMS 内部に織り交ぜられたナノファイバーネットワークを形成します。機械分析の結果、凍結乾燥 HP-GNMS の弾性率は 1.39 ± 0.19 MPa であり、ほとんどの従来のハイドロゲルスキャフォールドの弾性率を上回っていることが示されました。均一に分散したマイクロスフィアを含むバイオインクも優れた印刷性を示しましたが、UV架橋中にマイクロスフィア間の密接な接触が不足していたため共有結合の形成が妨げられ、PF-127を除去した後に印刷構造が崩壊しました。

図3 階層的多孔質GelMAナノファイバーマイクロスフィアスキャフォールド（HP-GNMS）とGelMAハイドロゲルスキャフォールド（GHS）の調製と特性評価
【HP-GNMSとGHSにおけるBMSCの増殖と浸透】

BMSCをHP-GNMSとGHSに播種し、階層的ナノファイバー構造が細胞の浸透と増殖に及ぼす影響を調査した（図4A）。細胞の成長ダイナミクスは明確な動作を示します。具体的には、GHS上の細胞は最初の5日以内に初期の指数関数的増殖期を示し、その後、より緩やかな定常状態期に移行しました（図3M）。対照的に、HP-GNMS 上の細胞は、10 日目まで続く長期かつ急激な指数関数的増殖期を経験し、その後、緩やかな増殖期に入りました。この違いは、HP-GMN の少なくとも 2 つの固有の特徴に起因します。まず、隣接するマイクロスフェア間の隙間が相互接続された多孔質ネットワークを形成し、移動と増殖のための十分なスペースを提供し、酸素と栄養素の拡散を促進します。第二に、ナノファイバー構造は高い表面積を提供し、細胞の付着と増殖に十分な接着部位を提供します。そのため、HP-GNMS 上の BMSC の成長は GHS 上の成長よりも活発でした。
図4 HP-GNMSおよびGHSにおけるBMSCの増殖と浸潤
HP-GNMSおよびGHSにおけるBMSCの骨形成分化

HP-GNMS 群では、SP7、Runt 関連転写因子 2 (Runx2)、オステオカルシン (OCN) などの骨形成遺伝子の発現レベルが GHS 群よりも有意に高かった。この上方制御は、骨形成（図5E-G）および非骨形成分化条件の両方で観察されました。 ALP染色では、HP-GNMS群のALP発現がGHS群よりも有意に高かったことが示された（図5A、B）。さらに定量分析により、HP-GNMSのALP活性は3日目、7日目、14日目にそれぞれGHSの2.2倍、3.5倍、4.2倍高かったことが示された（図5H）。アリザリンレッド染色では、HP-GNMS上で均一なミネラル沈着が示されたのに対し、GHS群ではわずかな量のミネラル沈着しか観察されなかった（図5C、D）。カルシウム沈着の定量評価では、HP-GNMS群のカルシウム沈着量は、7日目、14日目、21日目にそれぞれGHS群の9.3倍、16.6倍、19.0倍であったことが示された（図5I）。ウエスタンブロットでは、HP-GNMS群のCol-1発現レベルは14日目にGHS群の3.4倍であったことが示された（図5J、K）。免疫蛍光染色により、HP-GNMSの表面（図6A～C）、隙間（図6D）、およびナノファイバーマイクロスフェアの内部（図6D、E）にコラーゲン繊維が均一に分布していることが示されました。対照的に、GHS表面には少量のCol-1のみが沈着していた（図6F～J）。これらの結果は、HP-GNMS が GHS と比較して骨形成分化と ECM 沈着を著しく促進したことを示しています。

図5 骨形成条件下でのHP-GNMSおよびGHS上のBMSCの骨形成分化

図6 Col-1分泌とHP-GNMSおよびGHS上のBMSCの沈着
【生体内での骨再生】
BMSC を搭載したスキャフォールドは、3 日間の in vitro 培養後に欠損部位に移植され、等量の外因性幹細胞の存在下での HP-GNMS の骨再生に対する効果についての知見が得られました。この研究戦略は、ナノファイバー構造を持つ階層的多孔質足場が、内因性幹細胞の量が等しいことを模倣した条件下での骨再生に及ぼす影響を調査することも目的としています。マイクロCT解析では、HP-GNMS群の新生骨組織が欠損部を著しく覆い、空対照群およびGHS群と比較して有意に優れた骨形成能力を示した（図7A、B）。 HP-GNMS群の新骨量は、Empty群およびGHS群のそれぞれ7.3倍と6.6倍であった（図7E）。注目すべきことに、GHS グループでは、新しく形成された骨は主に GHS の表面に位置し、その結果 GHS 内部に空洞が形成されました (図 7B、青い矢印)。新生骨密度はすべてのグループで同程度でしたが（図7F）、ピクロシリウスレッド染色により、HP-GNMSグループの新生骨はより成熟しており、明るいオレンジ色で、コラーゲン繊維がより密に並んでいることが明らかになりました（図7D）。さらに、HP-GNMS グループでは、Empty グループおよび GHS グループと比較して、象牙質マトリックスタンパク質 1 (DMP1) の発現が有意に増加しました。DMP1 は、骨芽細胞の分化と成熟、骨細胞の形成、および正常な骨の石灰化の維持を制御する上で必須であり、HP-GNMS グループでは骨形成とリモデリングが強化されたことを示しています。

図7 BMSCキャリアとしてのHP-GNMSとGHSの8週間後の生体内骨再生能力の評価
【概要と展望】
ここでは、均一な GMNF-MS を製造するために、マイクロ流体工学と TIPS 技術を組み合わせたプロセスが開発されました。これらの GMNF-MS は、押し出しベースの 3D 印刷インクの基本的な構成要素として機能し、HP-GNMS の作成に使用されました。インクにPF127を加えた後、3DプリントによりGMNF-MSを効率的にHP-GNMSにすることができます。結果は、得られた HP-GNMS が BMSC の移動と増殖を促進することを示しました。さらに、GMNF-MS のナノファイバートポロジーは、骨形成の分化と ECM の沈着を導くのに役立つ物理的な手がかりを提供します。生体内研究では、HP-GNMS が骨組織の再生と統合を大幅に強化することが確認され、従来の 3D プリントスキャフォールドよりも優れていることが示されました。ナノファイバーマイクロスフィアの 3D プリントは、組織再生のためのバイオインスパイア材料を開発するための新しいアプローチです。

ソース：
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/smll.202405406

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