AM: 3Dプリント用の自己組織化両親媒性ペプチド

出典: 超分子バイオ製造押し出しベースの 3D バイオプリンティングは、生物に自然に存在する複雑な構造を複製するために広く使用されており、バイオインクの特性が非常に重要であるため、インク材料の開発は非常に有望です。現在使用されているバイオインクは、主にヒアルロン酸、アルギン酸、脱細胞化マトリックスなどの天然由来のハイドロゲル材料で構成されているか、これらの材料を化学修飾によって改質しています。この方法は、天然材料本来の生体適合性を維持しながら材料の印刷性を高め、印刷構造の忠実性と長期安定性を実現できます。現在、この分野では大きな進歩が遂げられていますが、単純な化学修飾法では、生物学的特性と印刷性のバランスを維持することが依然として難しく、バッチ間で差があり、安定した印刷品質を確保することが困難です。

自己組織化ペプチド（SAP）は、材料力学、生物学、化学における設計可能性のため、新しいバイオインクの開発に広く使用されています。SAPはアミノ酸成分のみで構成されています。設計された特定のSAPは、超分子アセンブリによって特定の構造のナノスケールポリペプチドに組み立てられ、その後、モジュール合成プロセスであるマクロ構造のハイドロゲルにさらに組み立てられます。SAPの特性は、一次構造シーケンスを変更するか、生理活性ペプチドシーケンスを追加するだけで変更できます。したがって、SAPは合成が容易、構成が明確、設計の柔軟性などの利点があり、幅広い材料特性を実現できるため、押し出しバイオプリンティングインクの開発において非常に魅力的です。
研究紹介 <br /> 米国ライス大学のジェフリー・D・ハートゲリンク教授のチームは、マルチドメインペプチド（MDP）を新しいバイオインクとして押し出し3Dバイオプリンティングに適用し、複雑な構造を作り出し、マルチマテリアルプリンティングを実現しました。in vitro実験を通じて、電荷の違いが細胞の活動と形態に与える影響を明らかにし、MDP内の電荷を調節することで細胞の挙動を探求し、制御しました。 MDP は、生理学的 pH およびイオン条件下でナノファイバーハイドロゲルを形成できる SAP の一種です。 MDP は、疎水性アミノ酸と親水性アミノ酸が交互に配置された基本構造を持ち、両側に荷電残基が配置されています。荷電イオン間の相互作用により、「疎水性サンドイッチ」が形成され、β シート構造を持つ整列した繊維に組み立てられ、適切な濃度で急速にゲル化してナノファイバーハイドロゲルになり、押し出し印刷のバイオインクとして使用できます。この論文では、反対の電荷を持つ 2 つの MDP を使用して 3D 印刷パラメータを最適化し、複雑なパターンを構築し、2 つのインクを組み合わせて in vitro でスキャフォールドを構築し、細胞の挙動を観察および制御しました。関連研究は、Advanced Materials 2023年1月号に「自己組織化ナノファイバーマルチドメインペプチドハイドロゲルの3Dプリント」と題する記事として掲載されました。（DOI: 10.1002/adma.202210378）
図1: MDPの組み立てと3Dプリントの原理の概略図
研究内容1. マルチドメインペプチドの特性評価この研究では、電荷の異なる2つのMDPを使用しました。1つはK2(SL)6K2の配列を持つカチオン性MDP（K2）で、もう1つはE2(SL)6E2の配列を持つアニオン性MDP（E2）です。円二色性の結果は、K2 と E2 の両方が特徴的な β シート構造 (図 2a) を示していることを示しており、その中で K2 配列はリジンのアミノ基とグルタミン酸のカルボキシル基の違いにより、より強い β シート構造を示しています。走査型電子顕微鏡により、K2 および E2 ハイドロゲルの繊維構造が明らかになりました。低倍率では、両方のハイドロゲルの表面は密な繊維構造を示し (図 2c、e)、高倍率では、両方のハイドロゲルのメッシュ構造が目立ちました (図 2d、f)。
図2: MDPの二次構造と微細ナノファイバーネットワークの特性評価
2. マルチドメインペプチドインクの印刷パラメータの最適化押し出しインク用の 2 つの MDP の印刷性を評価するために、レオロジー試験によってペプチド濃度がハイドロゲルの貯蔵弾性率に与える影響を評価しました (図 3a、e)。同じ濃度では、K2 ゲルの貯蔵弾性率 G' は平均して E2 ゲルの 4.2 倍でした。濃度勾配が増加するごとに、2 つの MDP ハイドロゲルの G' は約 2 倍増加しました。溶解性を確保する条件下で、レオロジー試験により、最高濃度（最高 G'）の MDP ハイドロゲルのせん断減粘性や急速な自己修復など、3D プリント可能なインクの基本的な特性が検証されました（図 3b、f）。
MDP の架橋方法は、共有結合架橋を必要とするほとんどのバイオインク材料の架橋方法とは異なります。MDP は、組み立てに超分子力のみに依存しているため、MDP ハイドロゲルは印刷プロセス中に動的に組み立てられた状態を維持できます。そのため、MDP の異なるバッチを使用し、温度と時間がレオロジー特性に与える影響を変化させることで、MDP ハイドロゲルの安定性を検証しました。レオロジー特性テストは各ハイドロゲルに対して 3 回繰り返され、構造は最初の結果と一致していました (図 3i)。さらに、MDP ハイドロゲルは 4 ～ 37 °C の間で安定したレオロジー特性を示し、2 つの 4% 濃度 MDP ハイドロゲルでは平均変化がわずか 5% 程度でした (図 3j)。これは、37 °C での in vitro 細胞接種または in vivo スキャフォールド移植に適しています。 MDP ハイドロゲルは 4 °C で保存した場合も長期安定性を示しました (図 3k)。 4 °C で最大 2.5 か月間保管した後、さまざまな保管期間におけるハイドロゲルのレオロジー特性の変化はごくわずかでした。時間に敏感なハイドロゲルと比較して、MDP ハイドロゲルは柔軟性が高く、オンデマンドで使用できます。
図 3: MDP ハイドロゲルと MDP インクのレオロジー特性。4% K2 インク、4% E2 インク、3% K2 インクの印刷パラメータは、Allevi 3 バイオプリンターを使用して最適化されました。最小押し出し圧力は、インクが長いフィラメント状に流れ出るまで、圧力を 0.5 PSI ずつ増加させることによって決定されました (図 4a)。 25G ニードルから押し出されたフィラメントの理想的な高さと幅は、ニードルの内径である 250 μm です。高速印刷では繊維が切れてしまいます。最小印刷速度は300mm/分です。この方法を使用すると、異なる仕様の針を使用する場合に最適な印刷速度を決定できます。最適な圧力と印刷速度を使用することで、3 つのインクによるオーバーハング印刷が可能になりました (図 4b)。 8 mm および 16 mm のオーバーハングでは、印刷された構造のわずかなたわみのみが観察されました。これは、非共有結合アセンブリが印刷された構造をサポートするのに十分な強度があり、共有結合による架橋の必要性を回避できることを示しています。 4% 濃度の K2 インクで正常に印刷されたシリンダーは、側面が滑らかで明らかな欠陥がなく (図 4c)、さらにさまざまな複雑な層構造に印刷できます (図 4d-g)。スキャフォールドは印刷後 24 時間 HBSS 溶液中で直接培養されましたが、構造と内部の多孔性は維持されていました (図 4h)。
図4: 3DプリントMDPスキャフォールドのパラメータ最適化とプリント構造
3. インビトロ実験この研究では、K2 スキャフォールド、E2 スキャフォールド、および K2 を第 1 層、E2 を第 2 層とした K2/E2 スキャフォールドを使用して、C2C12 細胞（マウス筋芽細胞）を接種し、細胞に対する電荷の影響を検証しました。結果は、E2 スキャフォールドと比較して、K2 スキャフォールドに接着する細胞が多く、増殖が良好であることを示しました。両方の MDP スキャフォールドで 5 日間培養した後、細胞数が大幅に増加しました。これは、E2 スキャフォールドの細胞への接着力が弱いため、細胞の増殖速度は遅くなるものの、増殖は妨げられないことを示しています。 K2/E2 スキャフォールド上で 10 日間培養した後でも高い細胞生存率が観察され、反対に帯電した MDP の結合が細胞毒性を引き起こさないことが確認されました。細胞増殖の違いも観察され、内側の K2 領域の細胞はよりよく伸長し、外側の E2 領域では細胞が融合しにくく、球状の細胞が多く見られました (図 5a、b)。アクチン染色により、筋芽細胞が K2 スキャフォールド上で筋管に融合し、複数の方向に伸びていることが示されました。 E2 スキャフォールド上の細胞は小さく、アクチンフィラメントの数も少なかった。K2/E2 スキャフォールド上の細胞形態は細胞成長領域のスキャフォールドによって決まり、近くの反対に帯電したペプチドの影響も受けた (図 5f)。K2 領域の細胞のアクチンフィラメントはより散在しており、明らかな核凝集が観察された。対照的に、E2 領域の細胞は主に球形をしており、細胞から突出しているアクチンフィラメントがいくつか観察されましたが、この現象は E2 ハイドロゲルのみから印刷されたスキャフォールドでは観察されませんでした。結果は、K2 インクと E2 インクを一緒に使用して、in vitro で細胞の挙動を制御できることを示しました。
図5: 異なる電荷を持つMDPスキャフォールドハイドロゲルのin vitro特性評価
ハイライトの要約: 1. MDP ハイドロゲルを設計することにより、全液体 3D 印刷用の新しい非共有結合架橋バイオインクが実現しました。印刷条件はシンプルで制御可能であり、インクの特性は安定しており、強力で、忠実度が高いです。2. MDP はポリペプチドのみで構成されており、構成はシンプルで明確です。また、印刷プロセス中に他の架橋剤を導入する必要がなく、非共有結合架橋アセンブリ方法により、ハイドロゲルの生物学的安全性が保証されます。3.細胞の活動や行動に影響を与える可能性のあるMDPハイドロゲルの電荷、機械的特性、およびその他の特性はすべて人工的に設計できるため、in vitro細胞実験のさらなる開発に最適な候補バイオインクになる可能性があります。将来的には、このバイオインクを使用して、より複雑な構造を印刷し、他のスキャフォールド特性がさまざまな種類の細胞に与える影響を調査できます。

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