西中国口腔科学の Weihua Guo 氏: 押し出し 3D 印刷を使用して HERS-DPC/GelMA スキャフォールドを構築し、歯槽骨の再生を促進します。

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

ヘルトヴィッヒ上皮根鞘 (HERS) は、歯の発達中に根尖に向かって成長する内側と外側のエナメル上皮によって形成される二重層上皮構造です。HERS の内側には歯乳頭細胞 (DPC) があります。歯根の発達中、HERS は DPC を象牙芽細胞に分化させるように誘導し、象牙芽細胞は歯根の象牙質の形成に関与します。しかし、HERS は歯根の発達過程の特定の時期にのみ短期間出現します。初代 HERS 細胞は数が少なく入手が困難です。従来の二次元培養環境では上皮特性が失われやすく、間葉系細胞への分化誘導能力が失われます。 HERS の上皮特性を維持し、上皮と間葉の相互作用を十分に発揮させる方法は、歯とその支持組織の再生の研究における難しさです。

最近、四川大学華西歯科病院の郭衛華教授のチームは、押し出し3Dバイオプリンティング技術に基づいてGelMAハイドロゲルを使用してSDラットのHERS細胞とDPCを再構成し、生体内実験を通じてHERS-DPC / GelMAスキャフォールドの骨形成能力を検証しました。関連論文「歯槽骨再生のためのヘルトヴィッヒ上皮根鞘細胞と歯乳頭細胞の3Dバイオプリント組換え構造」がInternational Journal of Bioprintingに掲載されました。第一著者はTang Huilin師範、責任著者はGuo Weihua教授です。

本研究の全体的な考え方は、歯の発達過程におけるHERSとDPCの空間的位置関係に基づいて「層状構造」モデルを設計し、GelMAハイドロゲルを足場材料として使用し、押し出し3Dプリント技術によってHERS-DPC / GelMA構造を構築し、その足場をSDラットの歯槽骨欠損部に移植して、足場が石灰化組織を生成し、歯槽骨欠損部の修復を促進する能力を検証し、歯関連の組織工学および上皮間葉系相互作用の研究に新たなアイデアを提供することです。

まず、研究者らはSDラットの歯胚からHERS細胞とDPCを採取した。光学顕微鏡で観察したところ、HERS細胞は塊になって成長し、敷石のような形をしており、DPCは長い紡錘形をしていることがわかった。免疫蛍光染色の結果、HERS細胞では上皮細胞マーカーCK14と間葉細胞マーカービメンチンの両方が陽性に発現していることが示され、HERS細胞が上皮間葉転換を起こし、上皮細胞と間葉細胞の両方の特徴を持っていることが示されました（図1、A）。

次に、HERS 細胞と DPC を 10% w/v GelMA 溶液で別々に再懸濁し、3D 印刷用の細胞密度が約 1×106/ml のバイオインクを得ました。この研究では、押し出し 3D プリンターの 2 つのプリントヘッドを使用して、最初に HERS 細胞の層を印刷し、次に DPC の 2 つの層を印刷して HERS-DPC の 3 次元層状構造を準備するなど、2 つのバイオインクの組み合わせ印刷を実現しました。単一細胞を含む同じサイズの 3 次元構造がコントロールとして使用されました。生細胞/死細胞染色実験の結果、培養後1日目、4日目、7日目にGelMAスキャフォールド内の生細胞の割合が80%を超えており、GelMAは優れた生体適合性を持ち、細胞増殖に適していることが示されました（図1、BおよびC）。

図1 HERS細胞の分離、培養、識別、生存率 HERS-DPCs/GelMAスキャフォールド内の2つの細胞間の相互作用をさらに調査するために、研究者らは蛍光染料DiOとDiLを使用して、それぞれDPCとHERS細胞を緑と赤でマークし、3Dプリント後0、3、8日目に共焦点顕微鏡で観察しました。結果は、8日目に2つの細胞が移動し、それらの境界がぼやけていることを示しました（図2）。
図 2 インビトロ HERS-DPC 相互作用光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡の結果から、3D プリントされた 3 次元層状構造は均一な細孔を持つグリッド状であり、直径は約 0.8 mm であることが示されています。培養後3日目から細胞がGelMAスキャフォールドから這い出て大量に増殖し、4日目には細胞集密度が80%に達し、この時点で細胞が良好な成長状態にあることが示されました。その後、研究者らはSDラットの歯槽骨移植実験を通じてHERS-DPC/GelMAスキャフォールドの骨再生効果を評価した。実験は、ブランクグループ、HERS細胞（3D）グループ、DPC（3D）グループ、HERS-DPC（3D）グループ、HERS-DPC混合グループの5つのグループに分けられました。ブランクグループにはいかなる材料も移植されず、HERS-DPC混合グループは、3Dプリントせずに2種類の細胞をGelMAハイドロゲルに直接混合したグループでした。 8週齢の雌性SDラットを選択し、右側上顎第一大臼歯と第二大臼歯を抜歯し、歯科インプラントマシンを使用して歯槽窩を作製し、標本をインプラントし、しっかりと縫合した（図3）。

図 3 印刷された構造と歯槽骨移植の顕微鏡観察。8 週間の観察後にサンプルを採取してさらに分析しました。 HE 染色とマッソン染色の結果、各グループの手術部位に新しく形成されたコラーゲン繊維が見つかったのに対し、ブランクグループの繊維は比較的少なく、細いことがわかりました。免疫組織化学染色の結果、骨形成マーカー（COL-I、OCN、RUNX-2）はDPC（3D）群とHERS-DPC（3D）群の両方で陽性発現し、HERS-DPC（3D）群では明らかな新生骨形成が認められました（図4）。

図4 歯槽骨移植は、8週間後にHE染色、マッソン染色、免疫組織化学染色によって評価されました。この研究では、GelMAを使用して、押し出し3Dバイオプリンティングに基づいてHERS細胞とDPCを再構築し、歯槽骨移植実験を通じて再構築された構造の骨形成特性を検証しました。研究結果によると、GelMA は優れた生体適合性を持ち、細胞の増殖、移動などの活動に有益であることが示されています。 3Dプリント法は、生体内での歯の発達中の微小環境を可能な限りシミュレートします。構築されたHERS-DPC共培養構造では、HERS細胞とDPCが移動し、SDラットの歯槽骨欠損部に移植した後、歯槽骨の再生に有益です。この研究は、歯原性上皮間葉相互作用を研究するための新しい戦略を提供します。

ソース：
http://doi.org/10.18063/ijb.v8i3.512

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