機能性インク設計とバイオ 3D 印刷技術を使用して半月板損傷を修復するにはどうすればよいでしょうか?

出典: EngineeringForLife

半月板損傷は、スポーツ医学の分野における大きな課題です。半月板損傷は、膝関節の異常な力の分散、潤滑の低下、安定性の低下によって引き起こされることが多く、軟骨の変性につながり、最終的には変形性関節症に発展する可能性があります。半月板は自己治癒力が弱く、修復が難しいため、移植、切除、縫合などの既存の治療法では病気の進行を根本的に止めることはできません。これは、効果的な治療法を見つけることの緊急性を浮き彫りにしています。組織工学技術の発展により、半月板損傷の修復と再建に関する新しいアイデアが提供され、特に半月板の自然な異質性を再現する研究が現在の研究の焦点となっています。

今号では、EFL は「Chemical Engineering Journal」誌に掲載された「部位特異的に調整可能な半月板脱細胞化細胞外マトリックス (MdECM) 強化バイオインクが異方性半月板再生を促進する」という研究を例に挙げ、複合インク構造と組み合わせた 3D 印刷技術によって、どのように分割された微細構造を持つ足場を準備し、半月板再生と軟骨保護を促進できるかを紹介しています。このスキャフォールドは半月板の自然な不均一性をシミュレートし、特定領域での細胞分化と細胞外マトリックスの沈着を通じて、各領域の機能の大幅な向上を実現し、異方性半月板再生を促進し、この方法がスポーツ医学の分野で潜在的な応用価値を持っていることを示しています。

1. この記事で紹介したバイオインクはどのように作られたのでしょうか?

➢ GelMA/HAMAハイドロゲルの調製

光架橋ハイドロゲルは、10% (w/v) メタクリロイルゼラチン (GelMA) と 2% (w/v) メタクリロイルヒアルロン酸 (HAMA) を使用して調製しました。GelMA 粉末をリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) に溶解し、完全に溶解するまで加熱した後、HAMA 粉末と 0.5% (w/v) 光開始剤 (LAP) を加えてよく混合しました。

➢ MdECM の統合と生理活性因子の添加メニスカス脱細胞外マトリックス (MdECM) 粉末を 2% (w/v) の割合で GelMA/HAMA 混合物に加え、領域特異的な細胞誘導を実現しました。特定領域における細胞分化をさらに促進するために、内側領域のバイオインクに10 ng/mLの形質転換成長因子β3（TGF-β3）を添加し、外側領域のバイオインクに100 ng/mLの結合組織成長因子（CTGF）を添加しました。

➢ バイオインクの最適化 GelMAとHAMAの比率、添加するMdECMの量、および生理活性因子の濃度を調整することで、バイオインクの物理的および化学的特性が最適化されました。これらのパラメータを正確に制御することで、最終的なバイオインクのゲル化特性、粘度、機械的強度を向上させ、さまざまな 3D 印刷のニーズや生物学的用途に適合させることを目指します。

2. 低酸素状態で前処理した軟骨前駆細胞を充填した GelMA マイクロスフェアを変形性関節症の治療にどのように使用するのですか?

図1 本研究の概略図

1) 光架橋バイオインクの調製と特性評価本研究では、豚の半月板から領域特異的なMdECMを抽出することに初めて成功しました。半月板の内側と外側の領域を分離して脱細胞化し、細胞外マトリックス構造とコラーゲンやグリコサミノグリカン (GAG) などの重要な成分を保持しながら細胞成分を除去することを目指しました。その後、処理された組織は凍結乾燥および粉砕プロセスを経て微細な MdECM 粉末に変換されました。このプロセスにより、脱細胞化法の有効性が検証されただけでなく、半月板の内側と外側の領域の生化学的特性と生物学的活性が保持されることが保証され、その後のバイオインクの調製と半月板組織工学の応用の基礎が築かれました。

図2 領域特異的MdECMの調製と特性評価

2) 領域特異的な MdECM バイオインクの調製と特性評価著者らは、半月板の自然な不均一性を模倣する MdECM ベースのバイオインクを開発しました。細胞の成長と精密な 3D 印刷に最も適した比率を見つけることを目的として、半月板の内側と外側のさまざまな領域からの MdECM を GelMA および HAMA ハイドロゲルと組み合わせて、異なる濃度の 4 つの MdECM ベースのバイオインク (G10H0、G10H1、G10H2、および G10H3) を準備しました。異なる比率のハイドロゲルは紫外線照射下で 30 秒以内に急速にゲル化することができ、MdECM を追加するとインクが透明から不透明に変化し、この変化によって細胞の付着と成長が改善される可能性があります。バイオインク中のGHおよびMdECM成分の均一性と構造安定性は、FTIR分析によって確認され、特に870 cm-1で観察されたC-OH結合伸縮ピークは、材料混合が成功したことを示しています。

レオロジー特性の評価により、すべてのバイオインクが剪断減粘挙動を示すことが明らかになりました。これは、3D 印刷技術による足場構造の精密な構築に極めて重要です。特に、G10H3 グループはより高い弾性率を示し、細胞の成長を支える構造により適している可能性があることを示しました。さらに、CTGF と TGF-β3 のゆっくりとした持続的な放出プロファイルは、これらのバイオインクが細胞微小環境に長期間成長因子を提供し、特定の細胞タイプの分化を促進する能力を強調しました。半月板の自然な微細構造は、スキャフォールドの微細構造設計を通じてシミュレートされました。外側領域の繊維は緩く大きな気孔を持つように設計され、内側領域の繊維はコンパクトでより小さな気孔を持つように設計され、半月板の内側と外側のさまざまな領域の物理的および生物学的機能をシミュレートするのに役立ちました。

図3 領域特異的MdECMバイオインクの特性

3) 領域特異的バイオインク強化スキャフォールドの生物学的評価著者らは、領域特異的バイオインク強化スキャフォールドの生物学的評価を実施した。細胞生存率試験の結果、外部領域バイオインクも内部領域バイオインクも細胞毒性を示さず、これらの生体模倣バイオインクが十分な細胞適合性を持っていることが実証されました。半月板の自然な形態と異方性構造をうまく再現するには、生化学的刺激を含む適切な信号を細胞環境に提供することが重要です。研究では、TGF-β3は軟骨遺伝子（COL2A1、ACAN、SOX9など）の発現レベルを高めることができ、CTGFは適切な刺激下で線維軟骨遺伝子（COL1A1、FN1、TNCなど）の発現レベルを高めることができることがわかりました。さらに、組織特異的蛍光標識の分析により、PGEF 群は、対照群 (PG 群) と比較して、内側領域で II 型コラーゲン (Col II) の発現レベルが高く、外側領域で I 型コラーゲン (Col-I) の発現レベルが高いことが示されました。さらに、リアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応（q-PCR）の結果から、PGEF グループでは、軟骨形成遺伝子（COL II、ACAN、SOX 9）と線維形成遺伝子（COL I、FN1、TNC）の両方の発現が、対応するコントロールグループよりも有意に高いことが示されました。結果は、開発された生体模倣ハイドロゲルが明らかな組織特異的な調節活性を持ち、軟骨形成および線維形成の微小環境をうまく模倣できることを示しました。したがって、PGEF は、体外において間葉系幹細胞を異方性線維軟骨分化へと誘導し、特定の領域で細胞外マトリックスを生成する能力があることが確認されました。

図4 領域特異的バイオインクはスキャフォールドの生体適合性を高める

4) 再生半月板の軟骨に対する保護効果を評価する
➀ 生体内で再生した半月板の肉眼的観察、MRI、生体力学的評価この研究では、ウサギの膝関節に領域特異的なMdECM強化構造体を移植した後の半月板再生を評価しました。各グループの組織形態形成は、MRI 分析を使用して冠状面と矢状面で評価されました。結果は、24週目にすべてのグループで新しい半月板が見られ、PGEFグループの再生組織は形状と輪郭において自然な半月板に近いことが示されました。さらに、PGEF グループの WORMS スコアは他のグループよりも有意に低く、天然半月板のスコアと同程度であり、PGEF スキャフォールドの優れた再生効果が強調されました。再生構造物の全体的な形態は 24 週間後に明らかになり、PGEF グループでは関節への統合がより良好で、より完全かつ均一な再生半月板が示されました。

機械的異方性を評価するために、半径方向および円周方向の縮小、内側および外側領域での二軸引張試験など、さまざまな引張試験を実施し、前部および後部コーナーの最大引張強度を分析しました。 24 週間の生体内テストの後、PGEF グループでは、円周方向の引張弾性率と収縮弾性率において、領域別 (内側 vs. 外側) の差異が見られることが観察されました。しかし、減少率と二軸引張弾性率に関しては、両領域においてPGEF群と天然群の間に差はなくなりました。さらに、PGEF グループの半径方向引張強度と極限引張強度は、コントロールグループの強度を上回り、自然グループの強度に近づきました。

図5 生体内での再生半月板の肉眼的観察、MRIおよび生体力学的評価

➁ 生体内で再生された半月板の組織学的評価さらなる実験により、PGEF グループの組織学的評価では、より領域特異的な細胞表現型と細胞外マトリックス沈着の分布が示され、これは天然の半月板と非常に類似していることが示されました。内側の領域は COL-2 とプロテオグリカンで構成された軟骨マトリックスを示し、外側の領域は COL-1 を特徴とする組織化された繊維状マトリックスを示します。半定量的研究および免疫組織化学により、外側のゾーンから内側のゾーンにかけて COL 1 の強度が減少し、それに応じて COL 2 の強度が増加することが明らかになりました。この生化学的組成は、天然の半月板の組成に似ており、外側領域は主に COL-1 で、内側領域のコラーゲンは主に COL 2 です。 PGEF グループの再生半月板組織の組織学的結果は、天然半月板の ECM の異方性組織に類似した、領域特異的な細胞表現型を示しましたが、対照グループでは差別的な細胞構造は示されませんでした。さらに、PGEF グループの内側領域には球状の軟骨細胞のような細胞が多く存在し、外側領域は紡錘形の線維芽細胞のような細胞が優勢であったため、半月板の自然な構造に似ていました。

図6 生体内で再生した半月板の組織学的評価

5) 局所特異的なMdECMベースの半月板強化構造の軟骨に対する保護効果。同時に、この研究では再生半月板の軟骨に対する保護効果についても議論されました。関節軟骨の全体的な外観を観察すると、PGEF グループは他のグループと比較して各時点で軟骨の変性が少ないことが示され、これは組織学的検査によっても裏付けられました。具体的には、対照群では、大腿骨顆部と脛骨プラトーの関節軟骨にかなりの乱れが見られ、トルイジンブルー染色および SO 染色では淡く見えました。国際軟骨修復学会（ICRS）スコアとマンキンススコアによると、対照群では軟骨損傷がより深刻でした。対照的に、PGEF 群は対照群よりも優れた軟骨保護能力を示し、組織学的染色によれば、PGEF 群には明らかな軟骨変性および亀裂は見られませんでした。これらの結果は、領域特異的な MdECM 強化スキャフォールドが異方性の生体模倣生体機能性を達成するだけでなく、機械的回復も促進することを示唆しています。

図7 生体内軟骨の組織学的評価

3. 本論文の革新性
この研究の主な革新性は、GelMA および HAMA ハイドロゲル調製プロセスと組み合わせた、領域特異的な脱細胞外マトリックス (MdECM) に基づくバイオインクの開発にあります。このバイオインクは、半月板の自然な不均一性を模倣するだけでなく、生物活性因子 TGF-β3 と CTGF の放出を正確に制御することで、特定の領域における細胞の特殊な分化を革新的に促進します。さらに、この研究では初めて3Dプリント技術とMdECMを組み合わせて、天然の半月板の構造と機能をシミュレートする組織工学スキャフォールドを正確に構築し、複雑な組織の再生と修復のための新しい戦略を提供しました。

4. 結論
この研究では、MdECM ベースの GelMA/HAMA バイオインクが半月板の自然な不均一性を模倣し、特定の細胞分化を促進する効果があることが実証されました。このバイオインクは、優れた構造安定性と印刷性能、および生体活性因子の長期にわたる安定した放出により、半月板損傷の修復や再生医療のための強力な材料基盤を提供します。試験管内実験では、細胞タイプ特有の分化と組織再生を促進する可能性がさらに検証され、3D 印刷技術を使用して半月板組織工学の足場を正確に構築できる可能性が示されました。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.cej.2023.145209

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