調整可能な機械的特性と細胞接着特性を持つ3Dプリントされたアルギン酸/ゼラチン複合ハイドロゲルが腫瘍スフェロイドを調節する

著者: 于英康

調整可能なバイオプリント可能なインクにより、生理学的に模倣した幅広い 3D モデルの作成が可能になり、in vitro 研究で体内の状態をより正確に模倣できるようになりますが、バイオインクを調整してバイオプリント可能かつ生体模倣にすることは、依然として重要な課題です。腫瘍微小環境 (TEM) は非常に動的なシステムであり、従来の 2 次元細胞培養技術では、TME を再構築し、in vitro で腫瘍スフェロイド (MCT) の形成を促進することは非常に困難です。最近、カナダのマギル大学のジョセフ・M・キンセラ教授率いるチームが、ゼラチンとアルギン酸塩で構成された人工複合ハイドロゲルを開発しました。3Dプリントされた乳房腫瘍モデルの機械的および生物学的特性は、2つの成分の初期濃度を変えることで調整できます。in vitro腫瘍スフェロイド（MCTS）の形成に成功し、このタイプのハイドロゲルを使用して、高スループット、低コスト、再現性の高い3次元疾患モデルを作成できることが示されました。（図1）。

図 1. 複合ゲルの生成、バイオプリンティングプロセス、およびバイオプリントされたアルギン酸/ゼラチンハイドロゲルにおける乳がん細胞の MCTS の生成を示す概略図。
研究者らは複合ハイドロゲル前駆体のバイオプリント可能性を分析し、AxGy のすべての組成 (AxGy: x% アルギン酸塩および y% ゼラチン) を、対応する最小圧力を使用してさまざまな初期時点で印刷できることを発見しました (図 2b)。すべての AxGy ハイドロゲル前駆体の中で、同じ (x + y) 値を持つサンプルの場合、ゲル化曲線は類似しています。図（2c-k）は、すべての印刷サンプルが構造を支えるのに十分な降伏応力で安定していることを示しています。ほとんどの印刷されたフィラメントの表面粗さは約 10% ですが、その中で A1G5 が最も悪く (18.4%)、A5G5 が最も優れています (6.5%)。さまざまなハイドロゲルの見かけのヤング率 (E) はアルギン酸の濃度に応じて調整でき、調整範囲は 5.46 ~ 22.88 kPa ですが、ゼラチンは E に明らかな影響を与えません (図 3)。

図 2. ハイドロゲル前駆体の印刷可能性。(a) 印刷されたメッシュモデルの CAD (単位: mm)。(b) は、アルギン酸とゼラチンの濃度が異なる前駆体の印刷ウィンドウを示しています。プロット内の各円形パネルは、1 種類の AxGy 前駆体を表しています。パネルの周囲の数字は、印刷前のゲル化時間 (分) を表しています。カラーバーは、室温で G27 円錐ノズルを使用して材料を押し出すために必要な最小圧力を示しています。(ck) は、AxGy で印刷された直方体メッシュモデルを示しています。印刷されたメッシュごとに、ゲル化時間、押し出し圧力、および正規化された粗さが表示されています。スケールバーは 1 mm です。(l) 最小押し出し圧力と降伏応力の散布図。赤の実線は式 (3) で定義される上限、緑の実線と緑の破線は式 (4) と (5) で定義される下限です。青の破線は線形回帰を表し、推定された式とフィッティングの良し悪しを示しています。(m) は、ゲージの幾何学的パラメーターを示しています。 27円錐ノズル。(n)は境界条件の明示的な式を示しています。

図 3. マイクロインデンテーションによる架橋後 24 時間で測定した見かけのヤング率。縦軸と横軸にゼラチンとアルギン酸の濃度をプロットし、カラーバーは見かけのヤング率の値を表します。アスタリスク (*) は、異なるゼラチン濃度のすべてのデータをプールして計算された 2 つのグループ間の有意差を表します (P < 0.05、n=10)。ns は有意差がないことを意味します。

一般的に言えば、より柔らかいハイドロゲルは MCTS を引き起こす可能性が高くなります。すべての AxGy サンプルは培養 7 日目に MCTS の形成を誘導し始め、実験は 28 日目に停止しました。結果は、A1G7 ゲルが培養 14 日後に中型および大型 MCTS の形成を促進した (図 4 (a、c)) のに対し、A3G7 は培養 14 日後に中型 MCTS を生成し、28 日後に大型 MCTS を生成したことを示しました (図 4 (b、d))。

図 4。バイオプリントされた A1G7 および A3G7 ディスクの共焦点画像と 28 日間の MCTS の定量分析。行 (a) と (b) は、それぞれ A1G7 と A3G7 における時間による形態学的 MCTS 変動を示しています。倍率は 10 倍です。画像 (c) は、28 日間の培養中の代表的な A1G7 サンプルの各スフェロイドの体積を示しており、小さい (15,000～200,000 μm3)、中 (200,000～700,000 μm3)、大きい (>700,000 μm3) MCTS のカテゴリが黒、赤、青で表示されています。(d) は、分類に同じしきい値を使用した A3G7 の同じデータを示しています。ボックスプロットグラフは、最小～最大のウィスカーの範囲で 25 パーセンタイルと 75 パーセンタイルのボックス制限を使用してプロットされました。
A1G7 または A3G7 の MCTS の状態を評価するために、研究者らは生死解析を実施しました (図 5)。 A1G7 と A3G7 ハイドロゲルの両方で細胞の高い生存率を示し、時間の経過とともに A1G7 の細胞と MCTS の増殖率が高くなったのに対し (図 5a)、A3G7 の MCTS の増殖率は 0 日目と同じであることがわかりました。さらに、高倍率3次元再構成画像を用いて、培養21日後にA1G7とA3G7によって形成されたMCTSの分布、体積、形態を調べたところ（図6）、A1G7はA3G7と比較してより大きなMCTSを生成できることが判明した（図6a、b）。

図 5。A1G7 または A3G7 ハイドロゲル内で 28 日間培養した MDA-MB-231 細胞の生存率。(a) 単一細胞と MCTS の生存率は 7 日ごとに測定され、0 日目に対して正規化されました。データは平均 ± SD、n≥3 として示されています。A1G7 (b) と A3G7 (c) の生きた MCTS (緑) と死んだ MCTS (赤) の共焦点画像。倍率 ×4、スケールバー 500 μm。
図 6. 培養 21 日後に A1G7 (a、b) および A3G7 (c、d) ハイドロゲルに形成された MCTS の代表的な形態とサイズを示す MCTS の 3D 再構成図。MCTS の拡大図は b) および d) に示され、スフェロイド内のアクチン組織を示しています。倍率 20、スケールバー 50 μm。
この研究は、カナダのマギル大学のジョセフ・M・キンセラ教授のチームによって完了され、2019年8月12日にBiofabrication誌にオンラインで公開されました。

論文情報:
Tao Jiang‡、Jose G. Munguia-Lopez‡、Kevin Gu、Maeva M. Bavoux、Salvador Flores-Torres、Jacqueline Kort-Mascort、Joel Grant、Sanahan Vijayakumar、Antonio De Leon-Rodriguez、Allen J. Ehrlicher、Joseph M. Kinsella*。腫瘍スフェロイドの成長を調節するための調整可能な機械的特性と細胞接着特性を備えたバイオプリント可能なアルギン酸/ゼラチン複合ハイドロゲルの設計。Biofabrication 2019、DOI:10.1088/1758-5090/ab3a5c。

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