寧波大学チーム：ハイドロゲル犠牲テンプレート法と3Dプリントを組み合わせて、チャネルネットワークを備えた足場材料をカスタマイズ

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

ハイドロゲルベースの 3D プリンティングは、複雑な細胞構造を正確に製造するための迅速な方法です。しかし、生体活性ハイドロゲルは機械的特性が弱く、チャネルネットワークを持つこれらのハイドロゲル構造は直接印刷プロセス中に安定しません。したがって、チャネルネットワークを備えた適切に構造化された構造を製造するには、適切なハイドロゲルを選択し、ターゲットを絞った製造方法を開発する必要があります。これを基に、寧波大学の金元教授と寧波大学医学・生物工学研究所の邵磊准研究員は、市販の3Dプリンターと水溶性ポリビニルアルコール（PVA）をベースにしたテンプレート犠牲3D印刷法を開発し、効果的なハイドロゲルチャネルネットワークを構築した。この3Dプリント技術を使用して、異なるチャネルネットワーク密度を持つ細胞搭載GelMA構造物を準備し、培養しました。実験結果では、チャネルネットワーク密度が高いほど細胞の成長が良くなることが示され、相互接続されたチャネルネットワークが酸素/栄養素の供給を加速し、細胞の成長を促進したことを示しています。関連する研究結果は、「チャネルネットワークを備えたハイドロゲル構造物の製造のための 3D プリント犠牲テンプレート」というタイトルで Materials & Design に掲載されました。

図1 ハイドロゲル3Dプリント犠牲テンプレートルートの概略図

具体的には、まず 3D プリンターを使用して PVA を犠牲テンプレートとして印刷しました。次に、GelMA 溶液をキャストして犠牲テンプレートをカプセル化し、光架橋しました。最後に、犠牲テンプレートが溶解され、チャネルネットワークが形成されます。犠牲材料として、PVA にはいくつかの利点があります: i) 溶解速度が良好であるため、その後の鋳造操作が容易になります。ii) 印刷された PVA フィラメントの真円度が高いため、チャネルネットワークの真円度も高くなります。iii) PVA 犠牲テンプレートは安定性が高く、長期保存が可能であるため、輸送、流通、使用に便利です。

1. 印刷速度とフィラメント/チャネル径の関係 チャネル径とチャネル密度は栄養素/酸素の輸送に大きな影響を与えるため、著者らはまず、印刷速度が PVA フィラメント/チャネル径と PVA 犠牲テンプレートの充填速度に与える影響を研究しました。実験では単層構造を構築し、印刷速度を変えることで直径の勾配を実現しました。実際の印刷から、印刷された単層構造には明らかな直径勾配があり、対応するチャネルにも明らかな直径勾配があることがわかります（図2）。 PVA 犠牲テンプレートが溶解する間、PVA フィラメントが膨張し、チャネルのサイズと構造全体の栄養素/酸素の透過性が増加します。

図2 印刷速度とフィラメント/チャネル径の関係

2. 異なるチャネルネットワークスキャフォールドによる栄養素輸送能力 PVA犠牲テンプレートの充填率を変えることで、異なるチャネルネットワーク密度を持つハイドロゲル構造を簡単に作製できます（図3a）。一方、異なるチャネルネットワークの栄養素輸送能力を検証するために、異なるチャネルネットワーク密度を持つこれらの GelMA スキャフォールドで栄養素輸送実験を実施しました。具体的には、足場の最初の層に赤色染料を注入し、栄養素の流れと拡散を観察しました（図3b）。染料の流れと拡散の実験により、栄養素ネットワーク全体が相互接続されており、栄養素の拡散能力はチャネルネットワークの密度とともに増加し、構造全体に栄養素/酸素が適切に供給されることが示されました。

さまざまな構造の機械的強度を調査し、さまざまな組織の製造のための強度基準を提供するために、さまざまなチャネルネットワーク密度を持つ構造の機械的特性を特徴付ける圧縮実験が実行されました。チャネルネットワークの密度が増加すると、構造強度が低下し、これらの構造の圧縮係数は約 1.1 ～ 3.6 kPa となり、一部の軟組織製造要件を満たすことができます (図 3c-d)。

図3 異なるチャネルネットワークスキャフォールドの伝送容量

3. ステントチャネルの忠実度 チャネルの忠実度を観察するために、構造を縦方向に切断し、そのスライスを光学顕微鏡で撮影しました（図 4a）。充填率が増加すると、チャネルの円形忠実度は低下します。これには 2 つの理由があります。i) PVA フィラメントが密集している場合、溶解中にフィラメントが膨張してチャネルが変形し、チャネルの忠実度が低下する可能性があります。ii) チャネルが非常に密集している場合、構造の機械的特性が弱くなり、重力によってチャネルが変形しやすくなります。

フィルレートが増加すると、チャネルの忠実度は低下し、フィルレートが 15% を超えると忠実度は急激に低下します。さらに、犠牲テンプレートの縦断面では、フィラメントの真円度が高く、隣接する層のフィラメントが相互接続されており、接続されたチャネルネットワークの構築が保証されていることがわかります (図 4c)。 PVA テンプレートを溶解した後、縦断面画像から、隣接する層のチャネルが相互接続され、栄養素/酸素の輸送が促進されていることが明らかになりました (図 4d)。

図4 ステントチャネルの忠実度

4. ハイドロゲルベースの血管チップの構築に使用 ハイドロゲルベースのチップを製造する能力を実証するために、著者らは異なる分布を持つ単層チャネル構造を製造しました (図 5a)。具体的には、鋳造中に、まず 37°C の GelMA 溶液の層を型の底に覆い、4°C で 5 分間冷却して、わずかに熱架橋させてわずかに粘着性のある状態にします。次に、単層犠牲構造をわずかに熱架橋した GelMA 上に配置し、液体 GelMA 溶液でカプセル化しました。最後に、構造全体を 15 秒間光架橋し、パラフィンフィルムを使用して型から分離し、37 °C の媒体に浸しました。 2時間後、ほとんどのPVAフィラメントが溶解し、残りのPVAはPBSで洗浄しました。

図5 ハイドロゲルベースの血管チップの構築の概略図

私たちの方法で自由形状のハイドロゲルベースの血管チップを構築できることを確認するために、さまざまな形状の印刷された PVA 犠牲テンプレートを使用して、三角形、四角形、五角形、六角形などの自由形状のチャネルパターンを製造しました。チャネルの実現可能性は、染色された PBS 溶液による灌流によって実証され、自由形状のチャネルパターンを製造するためのその戦略が血管チップで非常に実現可能な応用可能性を持っていることを示しています。

5. チャネルネットワークが細胞活動に与える影響 その後、著者らは、異なるチャネルネットワーク密度を持つ細胞を含んだ構造物をさらに作製し、培養しました。図6に示すように、チャネルの境界は明確であり、さらに培養すると細胞が徐々に伸びてつながり、ネットワークを形成します。チャネルネットワークの密度が高いほど、細胞間の接続が密になり、チャネル密度の増加に伴って栄養素/酸素の供給能力が増加することを示しています。

図6 チャネルネットワーク密度が細胞密度に与える影響

さらに、培養1日後、カルセイン（AM）とヨウ化プロピジウム（PI）を用いた生死染色により細胞生存率を評価した（図7a）。生死画像では、細胞が構造体内に均一に分布しており、生存率が高いことが示され、チャネルネットワーク密度の高い構造では、より十分な栄養素や酸素を供給できることが確認されました。チャネルネットワークが細胞の成長と移動を促進する能力を効果的に評価するために、培養期間 (3 日目、7 日目、10 日目) 後に細胞形態を特徴付け、画像化しました。細胞は徐々に広がり、ネットワークに接続しながら、徐々にチャネルに向かって移動しました (赤い矢印で示されています) (図 7c)。

図7 細胞生存率と細胞形態

要約すると、本論文では、効果的なハイドロゲルチャネルネットワークを構築するために、3D プリンターと PVA に基づく犠牲テンプレート技術を提案しています。市販の PVA フィラメントは水溶性で、溶解時間が短いため取り扱いが容易であり、また、市販の PVA フィラメントの高い機械的強度により、複雑な犠牲テンプレートの構築が可能になります。さらに、PVA 消耗品は安定性に優れ、長期間の保存が可能であるため、バッチ製造、輸送、循環、犠牲テンプレートの使用が容易になります。研究によると、テンプレートを犠牲にする 3D 印刷法では、高い活性を維持しながら細胞の拡散、増殖、移動を促進できるチャネルネットワークを備えた構造的足場を生成できることがわかっています。 PVA を犠牲材料として使用するこの足場構築技術は、三次元細胞培養および高生理活性組織の製造のための実用的な方法を提供します。

出典: https://doi.org/10.1016/j.matdes.2022.111012

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