GelMA 3D プリントハイドロゲル非同期薬物送達システムによる術後神経膠腫再発予防と神経再生

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

多形性膠芽腫（GBM）は中枢神経系の最も一般的な腫瘍であり、悪性度が最も高く、予後が極めて悪い腫瘍です。標準的な外科的切除と放射線療法および化学療法を組み合わせることで患者の生存率を大幅に向上させることができますが、併用治療を受ける患者は依然として 2 つの大きな問題に直面しています。1 つ目は、GBM の侵襲性が非常に高いため、外科的切除後も小さな腫瘍組織病巣が残り、GBM の再発率が極めて高くなることです。2 つ目は、再発した GBM は成長が速く、侵襲性が高く、治療に対する反応性が低いため、患者の生存が深刻に脅かされることです。第二に、外科的切除によって神経組織が損傷されることも、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします。したがって、GBM の再発と悪性転換の潜在的な分子メカニズムを理解し、適切な治療標的を見つけ、理想的な薬物送達システムを開発することは、GBM の再発を予防し、神経損傷を改善する上で非常に実用的な意義があります。

これを踏まえ、広州医科大学の Yao Maojin 氏、済南大学の Guo Rui 氏、華南理工大学の Ren Jiaoyan 氏は共同で、GBM の再発と術後の神経学的欠損という 2 つの課題に対処するための 3D 非同期薬物送達システムを開発しました。マウスの原発性および再発性 GBM 組織間の腫瘍細胞および腫瘍微小環境 (TME) 細胞のトランスクリプトーム解析に基づいて、mTOR 経路阻害とミクログリア/マクロファージの再分極を組み合わせた新しい二重標的アプローチが開発されました。次に、腫瘍切除腔にぴったりフィットし、二重標的薬剤の直接送達を実現するため、その場注入可能なゼラチンメタクリレート（GelMA）が構築され、生体内で優れた術後 GBM 阻害効果を示しました。同時に、神経栄養因子が浸透した3Dプリント（EFL-BP8601P光硬化バイオ3Dプリンターを使用）GelMAパッチを使用して3D非同期薬物送達システム（GelMA / TPNB）が構築され、神経栄養因子が徐々に下にあるハイドロゲルに浸透して軸索の発芽を促進できるようになりました。この 3D 非同期薬物送達システムは、腫瘍の再発を抑制する効果に影響を与えることなく、神経機能の回復を促進することは注目に値します。これを踏まえ、本研究では、新たな二重標的GBM治療戦略を提案しただけでなく、GBMの総合治療のための3D非同期薬物送達システムの構築を先導し、GBM患者の予後不良の改善が期待されます。この研究は最近、Advanced Functional Materials誌（doi/10.1002/adfm.202401383）に掲載されました。論文の責任著者は、広州医科大学の姚茂進教授、済南大学の郭睿研究員、華南理工大学の任嬌燕教授です。広州医科大学博士課程の胡楊氏、済南大学修士課程の周立明氏、南方医科大学第10付属病院（東莞人民病院）の王振寧医師が論文の共同筆頭著者である。

図 1 悪性神経膠腫の術後再発を抑制し、神経学的回復を促進するための非同期薬物送達用の埋め込み型 3D ハイドロゲルシステム (GelMA/TPNB) の組み立て。この研究では、ヒト神経膠腫の再発プロセスをシミュレートするために、マウスで再発性 GBM モデルを確立しました。ヒト腫瘍細胞のトランスクリプトームデータのDEGに対してGOおよびKEGGエンリッチメント解析を実施したところ、再発性神経膠腫では原発性神経膠腫と比較してEMT関連遺伝子の発現が増加していることが判明しました。次に、研究チームは、神経膠腫の浸潤、移動、血管新生を促進する分子基盤の詳細な分析を行い、再発性GBM腫瘍細胞でmTORシグナル伝達経路遺伝子の発現が上昇していることを発見しました。次に研究チームは細胞実験の結果を通じて、mTOR阻害剤テムシロリムスが神経膠芽腫細胞の増殖を効果的に抑制できることを確認した。さらに、悪性神経膠腫のもう一つの重要な特徴は、難治性の腫瘍免疫微小環境 (TME) です。研究チームは、マウス腫瘍微小環境細胞のトランスクリプトームデータ分析とヒトの原発性および再発性神経膠腫の単一細胞トランスクリプトームデータ分析を通じて、原発性神経膠腫と比較して、再発性神経膠腫の腫瘍関連マクロファージ（TAM）の表現型が、元の炎症誘発型（M1）から抗炎症型（M2）に変化していることを発見しました。次に、トランスクリプトームデータとデータベースの単一細胞トランスクリプトームデータの解析結果から、再発性神経膠腫では CSF-1/CSF-1R が高発現していることが示されました。そのため、研究チームは、腫瘍の微小環境を再形成し、腫瘍の免疫逃避と増殖を阻害するために、選択的 CSF-1R 阻害剤である PLX5622 を選択しました。動物実験の結果、PLX5622 はマウスの脳内のミクログリア細胞を効果的に除去できることが示されました。研究チームは、統合トランスクリプトームデータと単一細胞シーケンスデータの分析結果に基づいて、再発性神経膠腫の治療の潜在的な二重標的、すなわち腫瘍細胞と免疫微小環境細胞の両方を同時に標的とすることができるmTOR複合体とCSF-1/CSF-1Rシグナル伝達を発見しました。デュアルターゲットは、単一ターゲット薬剤では腫瘍細胞の増殖、拡散、薬剤耐性を完全に阻止できないという問題を効果的に解決できます。

図 2 原発性 GBM および再発性 GBM 腫瘍細胞における差次的発現遺伝子のバイオインフォマティクス解析図 3 原発性 GBM および再発性 GBM における差次的発現遺伝子のバイオインフォマティクス解析 TME 従来の阻害剤投与の深刻な副作用と脳内の血液脳関門による薬物送達の阻害を考慮して、研究チームは神経膠腫切除後の不規則な空洞にぴったり合う生体適合性メタクリレート修飾ゼラチン (GelMA) 注射用ハイドロゲルを開発しました。異物反応を避けるため、研究チームは、天然の脳組織と同様の機械的強度と生分解性を持つ、膨潤性の低い GelMA を 10% 質量分率で脳薬物送達キャリアとして使用することを選択しました。研究チームは、腫瘍細胞と腫瘍細胞が成長する微小環境に対する相乗的な阻害効果を生み出すために開発した新しい二重標的療法と組み合わせて、PLX5622とテムシロリムスを充填した10％GelMAハイドロゲル（GelMA / TP）を調製しました。

図 4 3D 非同期薬物送達システムの構築と特性評価ヌードマウスを使用して GBM 術後切除モデルを確立し、GelMA/TP ハイドロゲルの GBM 再発抑制効果を評価しました。実験結果では、GelMA/TP によりヌードマウスの全体的な生存率が大幅に改善され、切除後 120 日以内に 50% 以上のマウスが生存していることが示されました。 H&E 染色の結果、GelMA/TP 治療後、切除腔内の腫瘍細胞数が大幅に減少したことが示されました。免疫蛍光染色の結果、GelMA/TP を投与したマウスの脳組織には多数の BrdU 陽性細胞と少数の Ki67 陽性細胞が観察され、GelMA/TP が切除後の残存腫瘍細胞の増殖を効果的に抑制したことが示されました。さらに、GelMA/TP 群では、リン酸化 S6 リボソームタンパク質 (RPS6) が大幅に減少し、mTOR 経路遺伝子の発現レベルが大幅に低下し、血管新生が減少しました。さらに、GelMA/TP グループでは IBA1 陽性細胞の存在が大幅に減少し、M2 表現型に関連するマーカーがダウンレギュレーションされました。これらの結果は、GelMA/TP 治療が TME を調節して腫瘍の進行を防ぎ、神経膠腫の再発を軽減することを示唆しています。同時に、GelMA/TPハイドロゲルは脳に移植してから121日後に完全に分解され、末梢臓器のH&E染色結果には異常な病変は見られず、ハイドロゲルシステムの生分解性と生体適合性を示しました。

図 5 GelMA/TP は腫瘍の再発を大幅に抑制し、切除後の GBM マウスの生存期間を延長しました図 6 GelMA/TP は GBM 治療において mTOR 経路と TME を制御します GBM 手術後の神経学的後遺症を解決するために、研究チームは BDNF と NGF を搭載した 3D プリント GelMA パッチを構築しました。研究チームはスポンジ構造にヒントを得て、ステレオリソグラフィー3Dプリント技術によりマクロ多孔構造のGelMAハイドロゲルパッチを作製し、凍結乾燥パッチに神経成長因子（NGF）と脳由来神経栄養因子（BDNF）を滴下して因子浸透スポンジキャリアを作製した。次に、因子を充填したスポンジを GelMA インプラント材料の上に配置し、神経栄養因子がゆっくりと下方に拡散できるようにしました。動物実験の結果、この新しい 3D 薬物送達システムは、GBM の治療効果を妨げることなく、軸索発芽の可能性を効果的に促進できることが示されました。

図7 GelMA/TPNB処理後のマウス脳組織における軸索発芽とGBM阻害記事出典:
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adfm.202401383

GelMA 3D プリントハイドロゲル非同期薬物送達システムによる術後神経膠腫再発予防と神経再生

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