3Dプリントされたメソポーラスバイオグラス/PCLスキャフォールドは、マクロファージのM2表現型への分極を誘導し、BMSCの骨形成分化を免疫調節する

出典: EngineeringForLife

バイオセラミック複合ポリカプロラクトン (PCL) スキャフォールドは、骨欠損修復研究で広く使用されています。中でも生体活性ガラス（BG）は、そのユニークな無機非晶質構造、生体活性、骨結合特性により、優れた骨修復材料であると考えられています。しかし、通常の BG とメソポーラス BG の密な細孔と低い比表面積により、スキャフォールド全体の機械的特性と生体活性が制限されるため、これらの欠点を補うために BG の割合を増やす必要があることがよくあります。 3D プリンティングは、画像データとコンピュータ支援設計モデルの支援により、骨の構造と骨欠損の種類に基づいて、高精度の 3 次元エンティティを層ごとに直接製造することができ、骨組織工学で広く使用されています。ポリマーとバイオセラミックスの 3D プリントは、スキャフォールドの性能要件を大幅に満たすことができるため、現在注目されている研究トピックです。

広東科学院生物医学工学研究所の徐衛康氏のチームと遵義医科大学第二付属病院の倭清徳氏のチームは、比表面積と細孔サイズが大きい樹枝状メソポーラス生体活性ガラス（MBG）を開発した。 MBG 粉末をさまざまな割合で PCL と混合し、3D プリンターを使用して MBG/PCL スキャフォールドを準備しました。複合スキャフォールドの物理化学的特性と免疫協調骨形成性能を研究し、最高の圧縮強度と骨形成活性を備えた MBG 比率スキャフォールドを選択しました。最後に、最適な MBG 比に基づいて、異なる繊維径と細孔サイズを持つ MBG/PCL スキャフォールドを準備し、繊維の厚さと細孔サイズがスキャフォールドの物理化学的特性に及ぼす影響、およびマクロファージ (MP) の M2 表現型への分極の調節と骨形成能の促進に及ぼす影響を調査しました。

1. 主な内容

図1 MBGの特徴

MBG は、多数のナノスケールの小さな粒子が集積して形成されたマイクロスフィアです。ガラスマイクロスフィアは、分散性が良好で、表面がゆるく多孔質で、細孔が樹枝状に分布しています。 MBGのN2吸着脱着曲線は、メソポーラス材料のタイプIV等温線に準拠しています。計算によると、生体活性ガラスマイクロスフィアの比表面積は457.14 m2/g、細孔容積は1.38 cm3/g、平均細孔径は11.83 nmです。

図2 MBG/PCLスキャフォールドの表面形態と接触角

各グループのステントワイヤの直径は均一で、繊維の方向は 90° ずつずれています。ステント表面には散在する細孔があり、5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL、30MBG/PCLステントの表面にはMBG粒子が付着しているのが確認できます。高倍率顕微鏡下では、ステント表面の粗さはMBG含有量の増加とともに増加し、30MBG/PCLで最も顕著でした。これらの粗い表面は細胞に接着部位を提供することができ、細胞の増殖、分化、その他の行動を誘導するのに役立ちます。さらに、MBG を添加すると PCL 材料の親水性が向上し、改善の程度は MBG 濃度と相関していました。

図3 MBG/PCLスキャフォールドの物理化学的性質

PCLの特徴的なピークはすべてのグループのスキャフォールドに現れ、そのうち2850〜3000cm-1の-(CH2)4-はCH伸縮振動、1750cm-1はC=O伸縮振動ピーク、1150〜1250cm-1は-CO-を表していた。 MBG含有量の増加に伴い、PCL本来の特徴的なピークは徐々に減少しました。各グループのスキャフォールドの熱重量分析により、スキャフォールド内に残留する無機粒子の質量は、混合された MBG の割合と基本的に一致していました。スキャフォールドの圧縮抵抗試験では、MBG含有量の増加とともにPCLの圧縮抵抗が徐々に増加することがわかります。最も重要なのは10%です。しかし、これに基づくと、MBG 含有量の増加に伴い、足場の圧縮強度は徐々に低下しました。 20% および 30% の足場は、最大圧縮強度に達した後、急速に崩壊しました。これは、PCL で包まれた MBG 粒子が「海島」構造に似ているためです。 MBG（「島」成分）の含有量がさらに増加すると、PCL（「海」成分）の全体的な接続性能に悪影響を及ぼし、足場の最大圧縮強度が低下すると推測されます。同時に、MBG の大部分が PCL に凝集し、圧縮変形中に不均一な力が生じ、スキャフォールド全体が崩壊する原因となりました。

図4 MBG/PCLスキャフォールドの細胞適合性と骨形成特性

各グループのスキャフォールド上でのBMSC増殖のOD値は培養時間の増加とともに増加し、10MBG / PCLグループの増殖活性は他のグループよりも有意に優れていました。骨形成分化の初期段階では、5MBG/PCL、10MBG/PCL、20MBG/PCL の骨形成遺伝子 (ALP、OPN、BMP2) の発現レベルは 0MBG/PCL 群よりも有意に高かったが、30MBG/PCL 群と 0MBG/PCL 群の間には有意差は認められなかった。 COLI の発現において、MBG を含むスキャフォールドは純粋な PCL グループよりも有意に高かった。他のグループと比較して、10MBG/PCL グループのスキャフォールドが上記の遺伝子の発現の上方制御において最も顕著であったことは注目に値します。 RUNX2の発現においても、10MBG/PCL群は0MBG/PCL群および5MBG/PCL群よりも有意に高かったが、20MBG/PCL群および30MBG/PCL群とは有意差はなかった。骨形成誘導の 14 日後、10MBG/PCL グループは他のグループと比較して、OPN、RUNX2、BMP2、および COLI の発現が最も顕著に上昇しました。 ALP発現では、10MBG/PCLおよび20MBG/PCLは0MBG/PCL群よりも有意に良好であり、10MBG/PCL＞30MBG/PCLであったが、他の群間には有意差は認められなかった。 BMSCをスキャフォールドと共培養し、骨形成誘導7日後にALP定量分析を実施しました。10MBG / PCLグループのスキャフォールドのALP発現レベルは最も高く、他のグループ間では有意差はなく、ALP染色の結果と一致していました。要約すると、MBG を PCL 材料に添加すると、in vitro での骨形成性能が向上し、その中でも 10MBG/PCL スキャフォールドは BMSC の骨形成分化を促進する上で最高の性能を発揮します。研究により、BG によって放出される Si2+、Ca2+、および P5+ イオンは、BMSC や他の細胞と接触すると細胞周期を調節し、骨形成遺伝子の発現をアップレギュレーションまたは活性化することがわかっています。ナノサイズの BG はより強力な生物学的活性を持っています。より小さなサイズのバイオグラスは、細胞を G0/G1 期から S/G2 期に移行させる力がより強く、一方、より大きなサイズのバイオグラスは、より多くの細胞が G0/G1 期に留まるようにします。これが、MBG 含有量が 20% および 30% のスキャフォールドの増殖活性が低かった理由と考えられます (MBG は PCL 表面に凝集します)。

図5 MBG/PCLスキャフォールドの免疫調節特性

10MBG/PCL スキャフォールドは、マクロファージ M2 遺伝子 (CD206、ARG) の発現をアップレギュレーションし、M1 遺伝子 (TNF-α、IL-1β) の発現を阻害する上で最も顕著な性能を示します。純粋な PCL スキャフォールドと比較して、MBG は PCL に MP から M2 表現型への分極を促進する特定の能力を付与します。スキャフォールドを介した MP の M2 分極が BMSCs の骨形成分化を促進する可能性を評価するために、対応する MP 調整培地を各スキャフォールドグループに追加して、BMSCs の骨形成分化を促進しました。 10MBG/PCL 群では、MP 調整培地下で骨形成関連遺伝子 (ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2) の発現が最も顕著に上昇し、ALP 染色および定量化でも同様の結果が見られました。これは MBG の投与量に関係しているのではないかと推測しています。MBG の濃度が高いと、MP の M1 への分極化のプロセスが長引いて、M1 表現型遺伝子 TNF-α および IL-1β がより多く発現し、炎症の除去に悪影響を与える可能性があります。

図6 F300、F500、F800の表面形態と物理的・化学的性質

3D 印刷パラメータは、10MBG/PCL スキャフォールドをテンプレートとして使用して設定されました。均一な孔サイズ 500um と異なる繊維径 (300um、500um、800um) を持つ 3 つのブラケットグループが印刷され、それぞれ F300、F500、F800 とマークされました。スキャフォールドの親水性と圧縮強度は F500 で最高です。繊維径が200um減少すると、スキャフォールドの圧縮抵抗は15.72MPa減少します。繊維径が300um増加すると、スキャフォールドの圧縮抵抗は4.28MPa増加します。繊維が太くなると足場の力を受ける面積が増加するため、繊維が太くなるにつれて足場の全体的な圧縮強度が増加します。 3 つのグループのスキャフォールドの多孔度は、圧縮性能とは逆になっています。F500 と比較すると、F300 の多孔度は 1.73% 増加しましたが、F800 の多孔度は 6.06% 減少しました。

図7 P200、P500、P800の表面形態と物理的・化学的性質

均一な繊維径 500um と異なる孔サイズ (200um、500um、800um) を持つステントを印刷し、それぞれ P200、P500、P800 とマークします。 P500 の接触角が最も大きく、P200 と P800 の接触角には有意差はありませんでした。スキャフォールドの気孔サイズが大きいほど、多孔度が高くなります。同時に、気孔サイズが大きくなるにつれて、スキャフォールドの圧縮強度は低下します。これは、孔径が広がることでステントの力を受ける面積が減少し、圧縮抵抗が弱まるためと考えられます。

図8 F300、F500、F800細胞の増殖活性と骨形成特性

BMSC は異なる繊維径のスキャフォールド上に定着することができ、その中で F500 の蛍光数が最も多く、次いで F800 であり、これは細胞増殖の OD 値勾配と一致しています。これは、繊維が細いほど単位面積あたりのフィラメントの直径が多くなり、細胞が接着できる部位が増えるためです。しかし、F300 は曲率が比較的大きいため、初期の細胞接着に最もつながりにくいです。細胞接着の違いは骨形成能にも反映されています。F500 は骨形成遺伝子 (ALP、RUNX2、OPN、COLI、BMP-2) の発現を最も顕著にアップレギュレーションし、次に F300 が続き、最も低かったのは F800 でした。しかし、ALP 染色と定量化では F500 が依然として最高であったものの、F800 と F300 の間には有意差はありませんでした。

図9 F300、F500、F800はRAW264.7細胞の分極と骨形成特性の免疫調節を促進する

炎症遺伝子の発現においては、繊維が太く、孔サイズが大きいほど細胞外マトリックスの分泌と沈着が促進され、修復表現型 M2 遺伝子 (CD206、ARG) の発現につながる傾向があるようです。 F500 は M1 遺伝子 (TNF-α、IL-1β) の発現を著しく抑制しましたが、F300 は M1 遺伝子を著しくアップレギュレーションしました。ただし、3 日目には TNF-α の発現が F800 より F300 高くなりました。しかし、MP の M2 分極を誘導する F300 の性能は、F800 よりも優れています。これは、同じ領域で F300 の方が繊維の交差が多く、MP の伸張に役立ち、M2 分極を促進するためと考えられます。 MP 馴化培地の媒介により、F500 はさまざまな時点で骨形成遺伝子 (ALP、OPN、BMP-2、COLI) の最も顕著な上方制御を促進しました。 RUNX2の発現では、7日目にF500はF800より有意に高かったが、F300とは有意差がなかった。 14 日目には、F300 は F800 よりも優れていましたが、F500 は他の 2 つのグループと差がありませんでした。 F300とF800ではALPの染色と定量において有意差はありませんでしたが、F500はALPの分泌を有意に促進することができました。一般的に、骨形成の免疫調節に関しては、F500>F300>F800です。

図10 P200、P500、P800細胞の増殖活性と骨形成特性

スキャフォールドはBMSCと共培養されました。初日の増殖中、P800のODが最も高く、P200とP500の間に有意差はありませんでした。 3 日目と 7 日目には、P500 の細胞増殖活性が著しく増加しました。一般的に、BMSCの増殖活性はP500>P800>P200でした。この傾向は、共培養 3 日後の蛍光染色でも確認できます。 7 日目の ALP 染色と定量では、P500 が最も顕著な ALP 発現効果を持っていることがわかります。骨形成遺伝子 ALP、OPN、RUNX2、BMP-2、COLI の発現のうち、P500 は最も顕著な上方制御性能を示しました。より小さな孔径は骨形成組織の表現型の機能的分化を促進しませんが、十分に大きな孔径（> 250um）は骨の石灰化を促進します。 P500 は最も顕著な骨形成能を有しており、これは繊維径 500um、孔径 500um のスキャフォールドが物理的および化学的特性、細胞接着、および栄養交換の間で最適なバランスを保っているためと考えられます。

図11 P200、P500、P800はRAW264.7細胞の分極と骨形成特性の免疫調節を促進する

図11に示すように、大きな細孔サイズはMPのM2表現型への分極を促進するようです。 P300と比較して、P500とP800はCD206とARGの発現を有意にアップレギュレーションしました。一方、初日のARGの発現はP500＞P800でしたが、他のケースではP500とP800の間に有意差はありませんでした。 P200は炎症遺伝子（TNF-α、IL-1β）の発現を最も顕著に誘導し、次いでP800、P500は顕著な阻害効果を示した。 P200 と P800 の MP 分極を促進する能力は P500 よりも弱いですが、これはスキャフォールドの性能と細胞浸透の間の最適なバランスを達成できなかったことが原因であると考えられます。 MP 馴化培地の媒介により、P500 はさまざまな時点で骨形成遺伝子の発現を著しくアップレギュレーションし、P800 の in vitro 免疫骨形成性能は P200 よりも優れていました。同様に、ALP の染色と定量化においても、P500 が最も顕著な活性を示しました。

2. まとめと展望<br /> 私たちは、PCL スキャフォールドの全体的な圧縮抵抗と生体活性を向上させる、高活性 MBG を合成しました。その中で、10MBG/PCL は圧縮強度が最も高く (純粋な PCL スキャフォールドの約 2 倍)、in vitro 骨形成活性も最も優れています。 10MBG/PCL スキャフォールドは、MP の M1 表現型分極プロセスを大幅に阻害し、M2 抗炎症表現型遺伝子を上方制御しました。さらに調査を進めると、スキャフォールドの物理化学的特性と骨形成活性は繊維の厚さと気孔サイズの両方によって影響を受けることが明らかになりました。しかし、スキャフォールドの細孔サイズは、繊維の厚さよりも MP の分極を誘発する可能性があります。要約すると、繊維径 500um、孔径 500um の 10MBG/PCL スキャフォールドは骨形成能が最も高く、MP の M2 表現型への分極を著しく誘導できます。このグループは、マクロファージ分極を媒介し、BMSC の骨形成分化を誘導する能力が最も高く、骨再生を促す免疫微小環境を形成します。この研究は、BG複合PCLスキャフォールドの性能の探究において一歩前進し、骨移植材料の研究開発に新たなアイデアを提供しました。

参照: https://doi.org/10.36922/ijb.3551

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