蘇州大学科学の進歩: 3D プリントされた螺旋管状セルロース足場

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

腸内細菌叢は、人間の健康、および肥満、神経疾患、腸の炎症、外因性アレルギー、さらには癌などのさまざまな疾患の発生と進行に密接に関係しています。腸内細菌叢の調整は、微生物叢治療としても知られ、さまざまな健康状態を治療する可能性を秘めており、腸内細菌叢の構成と機能を意図的に変更することを伴い、医療研究の新しい分野です。プロバイオティクス、つまり有益な細菌の特定の株を腸内細菌叢に導入することは、腸内細菌叢を臨床的に調整するための有望なアプローチです。しかし、経口プロバイオティクスは、腸内細菌叢や全体的な健康上の利点に対して一時的または限定的な効果しか及ぼさないことがよくあります。まず、多くのプロバイオティクス菌株は胃酸や胆汁酸に敏感です。さらに、腸内細菌叢の構成は、経口プロバイオティクスを摂取した人の生存に影響を及ぼす可能性があります。微生物叢の乱れや腸の炎症状態は、プロバイオティクスの定着に理想的な環境を提供しない可能性があります。最後に、免疫力の低下や特定の病状など、個人の全体的な健康状態は、プロバイオティクスの生存と有効性に大きな影響を与える可能性があります。したがって、プロバイオティクスの適切な腸管送達と腸管内での長期保持および定着をどのように達成するかが、経口プロバイオティクス療法にとって非常に重要です。

東呉大学の王超氏のチームは、プロバイオティクスの経口投与を効率的に実現できる、3Dプリントされたセルロース由来のらせん管状足場を開発した。このシステムは、その独特な表面パターンのおかげで、近くの組織に侵入することなく、腸内での充填されたプロバイオティクスの滞留時間を効果的に延長し、充填されたプロバイオティクスの生存と長期的な定着に好ましい環境を提供し、分解後に食物繊維として腸内生態系に影響を与えることができます。ここでは、Roseburia intestinalis を配合したスキャフォールドが、腸内細菌叢の調節に重要な影響を及ぼし、肥満や炎症性腸疾患などのさまざまな腸関連疾患を治療することを示しています。したがって、この論文は、プロバイオティクスの経口投与のための多目的プラットフォームを提供します。関連研究は、トップジャーナル「Science Advances」に2024年8月23日に「プロバイオティクスの経口投与のための3Dプリントされた螺旋管のようなセルロース足場」というタイトルの記事として掲載されました。

1. 革新的な研究内容

ここでは、プロバイオティクスの経口投与を可能にし、腸内でのプロバイオティクスの長期保持と定着に理想的な環境を提供する、3D プリントされたセルロース由来のスパイラルチューブスキャフォールドを報告します (図 1)。バイオプリンティングは、生物医学分野で広く使用されている特殊な構造の製造を伴います。 3D プリントの独特な表面パターンのおかげで、近くの組織に侵入することなく、腸内での滞留時間を効果的に延長することができます。さらに、セルロースをバイオインクとして使用すると、好ましい環境を提供することでプロバイオティクスを胃酸や胆汁酸塩から保護し、有機燃料としてプロバイオティクスの生存と増殖をサポートし、食物繊維として腸内生態系に影響を与えることができ、これらすべての長期的な効果は、腸内細菌叢の調節に大きな影響を及ぼし、さまざまな腸関連疾患を治療します。

図1 プロバイオティクスの経口投与用3Dプリントセルローススパイラルチューブの概略図
【3Dブラケットの独自構造】

表面パターンは、相互作用する 2 つの表面の摩擦特性を決定する上で重要な役割を果たします。マイクロ溝の追加などの特定の表面処理は、さまざまな用途で材料の摩擦特性を意図的に変更するために使用できます。次に、さまざまなリングを備えた円筒形の 3D スキャフォールドと腸上皮細胞との相互作用を調査しました (図 2A および B)。リングの微細構造は走査型電子顕微鏡 (SEM) で素早く作製でき、細孔構造は約 12 μm (図 2C) であり、細菌のさらなる負荷とプロバイオティクスの生存の維持に最適です (図 2D)。リングの数は腸内でのチューブの摩擦に影響し、チューブに 4 つのリング (それぞれの長さ 1.5 mm) がある場合に摩擦が最大になりました (図 2E)。この発見にはいくつかの説明があります。まず、表面に 4 つのリングが付いた長さ 6 mm のチューブは、腸の表面と接触する表面積が大きくなる可能性があります。第二に、リングの深さと間隔も表面粗さに影響を与える可能性があります。 3 番目に、リングの数によって法線力が増大し、その結果摩擦が増大する可能性があります。この複雑なシステムの計算モデルは実験結果と一致しており（図 2F および G）、表面パターン化によって腸内での接着と保持が強化されるという考えを強く裏付けています。一方、4 つのリングを備えた 3D チューブも構造的に安定しており、他のチューブと比較して最高の圧縮応力耐性と圧縮弾性率を示しました (図 2H および I)。さらに、3D スキャフォールドの多孔性と水分含有量は、製造プロセス後も大きな影響を受けませんでした。
図2 3Dプリントされた足場の構造と関連する特性
3Dスキャフォールドにおけるプロバイオティクスの充填

3D チューブは腸内で優れた生体内保持能力を発揮するため、プロバイオティクスの経口投与プラットフォームとしての可能性をさらに探究しました。 Roseburia intestinalis (Ri) は、ヒトおよび動物の腸内に存在するプロバイオティクス細菌であり、代謝副産物として短鎖脂肪酸 (SCFA) を生成することで腸の炎症の調節に関与することができます。 Ri（図S7、AおよびB）をHMC-アルギン酸インクに封入することで、プロバイオティクスを充填したスキャフォールドチューブ（3D Sca@Ri）を室温で印刷しました（図3A）。各3Dスキャフォールドには、108コロニー形成単位（CFU）のプロバイオティクスが充填されています。走査型電子顕微鏡（SEM）では、スキャフォールド微細構造内に正常な棒状のRiが明らかになった（図3B）。その後、蛍光標識された Ri も 3D スキャフォールド内で検出され、プロバイオティクスのカプセル化が成功したことが確認されました。一方、さまざまな 3D スキャフォールドの形態構造と関連する物理的特性は、プロバイオティクスを充填した後も変化しませんでした。遊離 Ri と比較して、3D スキャフォールドチューブ内の Ri の増殖活性はわずかに変化しました (図 3C)。さらに、3D スキャフォールドは、胃酸や胆汁酸塩の作用下で、充填されたプロバイオティクスの活性を維持することができました (図 3D および E)。これは、印刷されたインクが胃酸や胆汁酸塩の腐食作用に対して比較的耐性があり、充填されたプロバイオティクスを保護するカバーを提供しているためと考えられます。

【腸管におけるRiの定着と滞留】
経口プロバイオティクスが腸内細菌叢に与える影響は通常一時的です。これは、経口プロバイオティクスの腸内での滞留時間が一時的に需要を満たすことができないためです。これまでの結果によると、HMC 3D ステントチューブは、その独特な構造と表面パターンにより、消化管内に長期間留まりました。この論文では、3D スキャフォールドチューブがラットの体内に充填された Ri の保持時間を延長できるかどうかをさらに調査しました。蛍光標識された Ri を 3D スキャフォールドチューブに充填してラットに与え、一方、遊離 Ri は対照として使用しました。遊離 Ri または 3D Sca@Ri を投与されたラットの腸は、さまざまな時点で in vitro で画像化されました。結果は、遊離 Ri のシグナルが 12 時間以内に急速に弱まったことを示しており、経口投与によって腸内の遊離 Ri のコロニー形成が大幅に減少したことを示しています。しかし、腸管内のスキャフォールド内に充填されたRiの滞留時間は非常に長かった（少なくとも72時間）（図3NおよびO）。ラットの糞便中の蛍光シグナルの分析 (図 3P および Q) と腸組織の免疫蛍光分析 (図 3R) によってさらに私たちの結果が裏付けられ、3D Sca@Ri を投与されたラットは、遊離 Ri を投与されたラットよりも Ri の排泄量が少ないことが示されました。さらに、遺伝子ルシフェラーゼタグ付けを使用することで、生物発光を利用して生体内でのプロバイオティクスの生体内分布を追跡することができます。対照群と比較して、3D Sca@Ri 投与後 144 時間経過してもプロバイオティクスのシグナルが依然として観察されており (図 3S ～ T)、これは、ハイドロゲルキャリアやプロバイオティクスの直接経口投与よりも、3D スキャフォールドが腸内でのプロバイオティクスのコロニー形成を効果的に促進したことを示しています。さらに、3D Sca@Ri を経口投与した後、実験動物の主な血液生化学指標に大きな変化は見られず、この戦略の生物学的安全性が実証されました。 Ri が腸内で長期間保持されることは、腸内細菌叢に大きな影響を与えるための前提条件です。

図3 3Dセルロース足場はプロバイオティクスの成長と定着を促進する
高脂肪食を与えられたラットの腸内細菌叢の調節

図 4A に示すように、高脂肪食 (HFD) を与えられたラットは、経口投与により 3D Sca@Ri 治療 (108 CFU) を週 1 回、合計 4 回受けました。同じ用量の遊離 Ri または空の 3D スキャフォールド (3D Sca) を対照として使用しました。 9 週目に、16S RNA を使用して、さまざまな処理後のラットの微生物群集を特徴付けました。 HFD は、さまざまな微生物種の相対的な存在量の不均衡につながる可能性があります。たとえば、HFD を摂取したラットでは、未摂取のラットと比較して、Firmicutes 属と Bacteroidetes 属の菌数が有意に減少しました (図 4B および C)。 3D Sca@Ri 治療により、対照治療と比較して、HFD を摂取したラットの微生物叢のバランスが改善されました。ここでは、HFD を与えられたラットにおいて、3D Sca@Ri 治療後に腸内微生物組成が著しく改善されたことが観察されました (図 4B および C)。この研究チームの以前の結果と一致して、遊離 Ri のみを摂取した場合、HFD を摂取したマウスの腸内の Ri の相対的存在量にはほとんど影響がなく、HFD を摂取したマウスでは Ri の定着が著しく影響を受けたことを示唆しています。対照的に、3D Sca@Ri を経口投与した後の Ri 細菌の相対的存在量は対照群と比較して有意に高く、3D Sca@Ri は Ri 単独の経口投与よりもラット腸内の Ri の活性とコロニー形成に大きな影響を与えたことを示しています (図 4D)。
図4 Riを充填した3Dスキャフォールドは、腸内の高脂肪食によって引き起こされる微生物の撹乱を改善し、腸内微小環境を再形成した。
【HFD誘発性肥満の治療における3D Sca@Riの効果】

3D Sca@Ri が肥満に関連する腸内微生物種と組成の調節において重要な役割を果たしていることから、次に、3D Sca@Ri がラットの HFD 誘発性肥満を逆転させることができるかどうかを調査しました。ラットにHFDを8週間与えた。 2 週目に、ラットは図 4A に示すように、3D Sca@Ri、遊離 Ri、またはブランクのスキャフォールドで処理されました。遊離 Ri またはブランクのスキャフォールド単独では体重増加にほとんど影響がなかったものの、3D Sca@Ri は絶対体重増加と相対体重変化率の両方を含め、体重増加を著しく遅らせました (図 5A ～ C)。同時に、実験ラットの白色脂肪組織（WAT）も採取されました。ブランクのスキャフォールドまたは遊離の Ri を投与されたラットは、セルロースの弱い調節効果により脂肪形成がわずかに減少しましたが、3D Sca@Ri を投与されたラットでは WAT 形成が著しく抑制されました (図 5D ～ F)。さらに、3D Sca@Riを投与されたラットのLee指数とBMIも対照群と比較して改善され（図5GおよびH）、トリグリセリド（TG）、総コレステロール（TCHO）、低密度リポタンパク質コレステロール（LDL-C）、高密度リポタンパク質コレステロール（HDL-C）などのさまざまな主要な脂質生化学マーカーは、治療後に正常化する傾向がありました（図5I～L）。
図5 プロバイオティクスを充填した3Dセルロース足場は免疫微小環境を改善し、肥満を抑制した
【3D Sca@Riの炎症性腸疾患（IBD）に対する治療効果】

本論文では、本論文で提案した腸管送達システムの適用範囲をさらに拡大するために、他の腸管関連疾患の治療におけるその有効性を検討します。クローン病や潰瘍性大腸炎などの炎症性腸疾患（IBD）は、消化管の慢性的な炎症を特徴とする病気です。 3D Sca@RiのIBD治療における有効性を調べるために、ラットにデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）塩を7日間経口投与し、急性腸炎を誘発した（図6A）。 IBD ラットは、前述のとおり、3D Sca@Ri、遊離 Ri、またはブランクのスキャフォールドで治療されました。同様に、3D Sca@Ri は腸内細菌叢の豊富さと多様性を大幅に変化させました (図 6B ～ E)。 3D Sca@Riを投与されたラットでは、Riの個体数が遊離Riを投与されたラットよりも有意に増加しました（図6F）。さらに、関連するプロバイオティクスと関連する短鎖脂肪酸の量も大幅に増加しました。しかし、病原細菌の存在量は減少した（図6G～J）。主成分分析 (PCA) により、ラットの腸内細菌叢は正常レベルに戻る傾向にあることが示され、さらに治療によって腸内細菌叢の不均衡の修復が促進され (図 6K)、ラットのさまざまな短鎖脂肪酸のレベルが最高になったことが確認されました (図 6L)。

図6 3Dセルロース足場プラットフォームが急性腸炎を制御する
2. まとめと展望<br /> 要約すると、この論文では、独自の表面パターン化により腸内での滞留時間を効果的に延長する、セルロース由来の 3D プリントされたプロバイオティクス送達媒体を設計しました。さらに、3D プリントされたキャリアは、充填されたプロバイオティクスの生存と定着を促進し、腸内細菌叢の異常を改善し、腸の炎症を調節することができます。この記事では、ラットの肥満および炎症性腸疾患の治療における 3D プリントされたプロバイオティクス送達媒体の治療効果を実証します。このアプローチは、プロバイオティクスのコロニー形成効率を改善し、腸関連疾患の治療を促進するための潜在的なプラットフォームを提供します。

ソース：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.adp3654

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