高性能ハイドロゲルの3Dバイオプリンティングと幹細胞スフェロイドのin situ生成

出典: EngineeringForLife

デジタル光処理 (DLP) ベースのバイオプリンティング技術は、生物医学用途のハイドロゲル構造の開発に大きな可能性をもたらします。しかし、このアプローチを使用して高性能のハイドロゲル構造を作成することは、マトリックスの物理化学的特性のバランスを取りながら、カプセル化された細胞の細胞活動も維持する必要があるため、依然として課題となっています。ここで、第三軍医大学大平病院のLiu Rui氏らは、幹細胞スフェロイドをその場で生成することにより、高性能ハイドロゲル構造を3Dバイオプリントするシンプルで実用的な戦略を提案しました。この戦略は、ゼラチンメタクリロイル (GelMA) エマルジョンに細胞/デキストランの微小液滴を充填することによって実行されます。デキストランはバイオプリンティングのために細胞を捕捉して凝集するための餌として機能し、GelMA は構造の複雑さと忠実性を失うことなく機械的サポートを可能にします。バイオプリンティング後、デキストランの浸出によって滑らかな曲面が形成され、ハイドロゲル構造内での球状体のその場生成が容易になりました。このプロセスにより、カプセル化された幹細胞の分化能力が大幅に向上します。この研究では概念実証として、歯髄幹細胞（DPSC）をハイドロゲル構造内に封入し、生体内での象牙質および新生血管様構造における再生能力を実証しました。この研究戦略により、DLP バイオプリンティングに基づく高性能ハイドロゲル組織構造の製造が可能になり、さまざまな生物医学的アプリケーションへの有望な道が開かれると期待されています。

関連研究内容は、2024年9月29日に「Bioactive Materials」に「幹細胞スフェロイドの原位置誕生を伴う高性能ハイドロゲルの3Dバイオプリンティング」というタイトルで掲載されました。

図 1 バイオインクの特性バイオプリンティングプロセス中に幹細胞スフェロイドをその場で形成できるようにするため、本研究では、細胞濃縮バイオインク (CCB) と呼ばれる異方性バイオインクを開発しました。これは、カプセル化された幹細胞を捕捉するための細胞ベイトとしてデキストランを使用し、構造サポートを提供するマトリックスとして GelMA を使用し、高性能ハイドロゲル組織構造のバイオプリンティングを容易にします (図 1a)。ハイドロゲル構造の形成に基づいて、すべてのハイブリッド細胞はデキストラン溶液に集中しており、GelMA溶液ではシグナルが検出されませんでした（図1b）。 2つの相を組み合わせるだけで、異なるサイズ分布を持つデキストラン液滴が得られます（図1c）。 CCB ハイドロゲルが固化した後、24 時間以内に 80% を超えるデキストランが効果的に除去されました (図 1d)。さらに、この研究では、得られたハイドロゲル構造の機械的特性も評価しました（図1e）。 CCK-8アッセイの結果は、多孔質構造がカプセル化されたNIH/3T3細胞の増殖を促進することを示しました（図1f）。生死蛍光染色により、バイオインクは 5 日間培養後もカプセル化された細胞に対して毒性がないことが示されました (図 1g)。走査型電子顕微鏡（SEM）により、15% グループの細胞は凝集して拡散した形態を示しているのに対し、標準、10%、7.5% グループの細胞は丸いことが確認されました（図 1h）。生死アッセイと SEM 画像でも、細胞群の 15% で望ましい細胞生存率が示されました (図 1i)。上記の結果に基づき、組織構造を印刷するために、10% (w/v) デキストラン溶液と 15% (w/v) GelMA 溶液を 1:2 の体積比で混合しました。

図 2 バイオインクの印刷性最適化されたバイオインク配合を利用して、この研究では、単純な 2D パターンから複雑な内部および外部構造を持つ 3D 構造に至るまで、いくつかの代表的な構造を印刷し、印刷性を評価しました。バイオインクを利用して、さまざまな形状（車輪、ハート、半月板など）の無細胞スキャフォールドを作成することに成功しました（図 2a-c）。同時に、この研究では、細胞を充填したバイオインクを使用して生体模倣構造を印刷し、指定された領域に細胞を正確に配置して、より正確な生理学的特徴を導入する可能性を調査しました。図 2d～f は、バイオインクを使用した DLP バイオプリンティングによって、神経膠芽腫モデル、重層皮膚モデル、血管前肝臓ハイドロゲルモデルなどの複雑な組織構造を製造できることを示しています。上記の結果は、バイオインクが高精度の構造を製造できる能力を実証しています。

図 3 ハイドロゲル構造の 3D バイオプリンティングは、カプセル化された幹細胞の活動を調節し、MSC スフェロイドの in situ 形成を促進できます。図 4 ハイドロゲル内の rDPSC の多系統分化この研究では、細胞が豊富なバイオインクが開発され、提案されたバイオインクが幹細胞スフェロイドの in situ 生成を促進できるという仮説が立てられました。この仮説を実証するために、ラットの歯髄幹細胞 (rDPSC) が使用されました。図 3a に示すように、ハイドロゲルに封入された rDPSC は、培養後 5 日以内に高い細胞適合性を示しました。 H&E染色およびファロイジン染色により、バイオインクがMSCの3Dクローン増殖を促進することがさらに確認されました（図3b、c）。幹細胞の凝集に加えて、CCB グループに封入された rDPSC の増殖も大幅に促進されました (図 3d)。次に、ハイドロゲルに封入されたrDPSCの多能性を遺伝子発現レベルで調べたところ、CCB群では幹細胞マーカー（OCT4、SOX2、NANOG）の発現が著しく増加していることが示されました（図4e）。この結果は、幹細胞をカプセル化して球状体の形成を促進し、その結果として幹細胞の特性の維持を強化するというバイオインクの独自の利点を実証しています。本研究では、転写応答をさらに調査するために、異なるハイドロゲル構造下で培養された rDPSC のトランスクリプトーム配列解析 (RNA-seq) を実施し、その違いを分析しました。ボルケーノプロットでは、2つのグループ間で1018個の遺伝子の発現に差があり、そのうち444個の遺伝子がダウンレギュレーションされ、574個の遺伝子がアップレギュレーションされていることが示されました（図3f）。 CCB グループでは、幹細胞関連遺伝子 (Egr2、CD44、Lif、Klf4、Klf6) の発現が有意に上昇していました (図 3g)。 GOの濃縮は、細胞外マトリックスの濃縮、外部刺激への反応、細胞間接着の調節、サイトカインを介したシグナル伝達経路、栄養素への反応、および組織のリモデリングとして現れました（図3h）。 CCB ハイドロゲル構造における in situ rDPSC スフェロイド形成に対する転写応答をさらに調査するために、接着、細胞外マトリックス組織化、および血管新生に関連する代表的な遺伝子の発現変化を表示するヒートマップが生成されました (図 3i)。分析の結果、Cdh13、Lgals1、Megf10、Abi3bp は細胞接着に密接に関連しており、Col27a1、Mmp13、Mmp14、Adamts7、Gas6 は細胞外マトリックス組織の調節に関与する重要な遺伝子であり、Fgf22、Vegfa、Vegfb、Bmp4 は血管新生に関与していることがわかりました。遺伝子セットエンリッチメント解析（GSEA）では、細胞接着分子、細胞接合、細胞外形成の正の調節のエンリッチメントが示されました（図3j）。要約すると、rDPSC の CCB ハイドロゲルカプセル化は、これらの生物学的プロセスと分子機能の強化を促進し、組織の再生に有益でした。

カプセル化された rDPSC の分化能力を調べるために、調製したハイドロゲル構造を対応する分化培地とともにインキュベートしました。図 4a ～ d に示すように、CCB グループの rDPSC は培養中に標準グループの細胞よりも高いレベルの骨形成マーカー遺伝子を発現しました。図 4m に示すように、CCB グループの rDPSC ではミネラル沈着がより多く見られました。標準グループと比較して、実験グループのカプセル化されたrDPSCは、II型コラーゲンとSOX9の軟骨形成遺伝子発現レベルが高かった（図4e、f）。対照的に、標準グループにおけるCol-1およびCol-xの遺伝子発現は培養時間の延長とともに減少しましたが、カプセル化されたrDPSCにおけるそれらの発現はCCBグループにおける発現よりもはるかに高かった（図4g、h）。誘導後 21 日目に、サフラニン O 染色によりプロテオグリカンを豊富に含むマトリックスの存在が確認されました。 CCB グループではサフラニン O 染色の強度が強く、GAG 産生が最も高かったことを示しています (図 4n)。ハイドロゲル構造では、カプセル化されたrDPSCの脂肪分化は骨形成および軟骨形成の分化と同様の結果を示しました（図4i-l、図4o）。要約すると、CCB ハイドロゲルは幹細胞スフェロイドの原位置生成を促進し、それによってその増殖、多能性、および分化を高めることができます。

図 5 バイオプリントハイドロゲルの血管新生への応用この研究では、ヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC) を使用して、チューブ形成および移動実験を通じて CCB ハイドロゲル構造の血管新生能を評価しました。図 5a に示すように、DPSC を充填した CCB ハイドロゲル構造の馴化培地で培養された HUVEC は、対照群を上回る、毛細血管のようなネットワーク構造を形成する顕著な能力を示しました。血管新生パラメータの大幅な改善は、血管ネットワーク形成を促進する CCB ハイドロゲル構造の性能向上を強調しています (図 5b)。 CCB グループでは、標準グループと比較して、移動する HUVEC の数が有意に高かった (図 5c)。次に、hDPSCとHUVECを組み合わせて混合細胞スフェロイドを作成し、生体内での新しい血管の形成を評価しました。バイオプリントされたハイドロゲルはヌードマウスの背中に埋め込まれました（図 5d）。 CCB グループでは、ハイドロゲル全体に赤血球で満たされた豊富な血管ネットワークが観察され (図 5 e)、強力な血管新生を示しています。 H&E定量化の結果、CCB群の血管密度、平均血管径、および内腔密度は標準群よりも高かったことが示された（図5h）。 CCB 群の CD31 陽性領域は有意に増加しており (図 5f、i)、これはハイドロゲル構造が体内での新生血管の形成を効果的に促進したことを示しています。微小血管はヒトCD31陽性染色を示し、血管腔内に移植されたHUVECの存在を確認した（図5g）。

図 6 皮下モデルにおける歯髄様組織の再構築ラット由来象牙質マトリックス (TDM) の根のスライスを 3D バイオプリントハイドロゲルで充填し、SD ラットの皮下に移植して (図 6a i)、血管新生と歯原性分化を実現しました (図 6a ii)。移植後8週間で、移植部位の中心部と周辺部を組織学的に評価した（図6b）。 H&E 染色の結果、標準グループのスキャフォールドには細胞含有量がなく、近位端に少量の組織浸潤が見られましたが、CCB グループでは顕著な組織再生が見られました (図 6c、d)。マッソントリクローム染色では、CCB グループでコラーゲン繊維が明確に確認されました (図 6e)。免疫組織化学では、CCB グループで歯原性 DSPP (図 6f)、血管 CD31 (図 6g)、神経 NF200 (図 6h) などの関連マーカーの発現が増加していることが示され、CCB ハイドロゲルが歯髄象牙質複合体様組織の再構築を効果的に促進したことが確認されました。

全文の要約<br /> 要約すると、この研究は、幹細胞スフェロイドの原位置形成を伴う組織構造の DLP ベースのバイオプリンティングをサポートするために、細胞が豊富なバイオインク CCB が適用可能であることを実証しました。この研究で開発されたバイオインクは、高性能ハイドロゲル構造の製造を容易にし、構造の複雑さと忠実性を維持しながら細胞生存率を大幅に向上させます。これらの構造により、埋め込まれた細胞がデキストラン相に効果的に集中します。湾曲した形態と高い細胞密度の影響を受けた幹細胞は、球状に凝集する傾向があり、その結果、幹細胞の幹細胞性と分化能力が向上します。さらに、この研究で使用されたハイドロゲルは、生体内で血管新生をサポートし、象牙質を再生する能力があることが実証されました。上記のデータに基づいて、本研究では、細胞濃縮バイオインクを使用して幹細胞スフェロイドをその場で生成することにより、ハイドロゲル組織構造をバイオプリントするシンプルで実用的な戦略を提案しており、これは組織工学と再生医療において大きな可能性を示しています。

出典: https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2024.09.033

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