組織再生のための表面機能構造を備えた 3D プリントされた強靭なハイドロゲル足場

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

体内の多くの組織の主成分は、優れた強度と靭性を持つタンパク質ベースの有機物質です。組織の再生や修復に一般的に使用される生物学的ハイドロゲルも、天然組織から抽出したゼラチンを主成分としています。しかし、抽出と工学処理後、その生物学的特性はほぼ保持されますが、強度と靭性は失われます。そのため、現在のバイオハイドロゲルや印刷されたハイドロゲル足場のほとんどは柔らかく脆く、機械的特性が劣っています。体の中にある強さや強靭さを体外で回復させることは可能なのでしょうか？

2023年、EFLチームは、ゼラチンベースのハイドロゲルの強度を145倍に高める機械的トレーニング方法を報告しました。しかし、この研究の限界は、この方法を 3D プリントと統合することができず、秩序だった 3 次元構造を実現することが難しいことです。この研究では、このギャップを埋めるために、普遍的で強靭なハイドロゲル足場の製造方法（印刷-P、トレーニング-T、架橋-C）を提案しました。 3Dプリントと光架橋によりカスタマイズされた構造を準備し、集中的なトレーニングの成果を固定することで、ハイドロゲルスキャフォールドの強度が622倍に増加しました。さらに、3Dプリントされたカスタマイズされた多孔質表面機能構造を備えた強靭なハイドロゲルスキャフォールドを準備し、その有効性を確認するために一連の生体内移植実験を実施しました。

まず、3Dプリントにより、目的の構造を持つハイドロゲル足場（P）を作製しました。その後、塩析を補助とした周期的な機械的トレーニング (T) により、スキャフォールドは極めて高い機械的特性と機能的な表面構造を備えることができます。最後に、光架橋によってトレーニング結果が固定されます (C)。得られた強靭なゼラチンハイドロゲルスキャフォールドは引張強度に優れ、優れた生物学的特性を確保しながら、強度は6.66 MPa（未処理の622倍）に達します。

このスキャフォールドは、ナノメートルからマイクロメートル、ミリメートルまでの範囲の機能的な表面構造を持ち、細胞の方向性成長を効果的に誘導することができます。この方法は、スキャフォールドの機械的特性を調節することで、10 kPa-10 MPaの人体組織のバイオニクスも実現できます。また、これはゼラチンやシルクフィブロインなどの多くの生物学的ハイドロゲルの強度を高めるために使用できる一般的な戦略であることも実証しました。動物実験を通じて、この強力なハイドロゲルシステムは優れた生物学的特性を持ち、欠陥組織の急速な再生を促進できることを実証しました。

関連研究は、「組織再生のための機能的表面構造を備えた強靭なハイドロゲル足場の 3D 印刷」というタイトルで Nano-Micro Letters に掲載されました。浙江大学のHe Yong教授と浙江大学口腔病学院のXie Zhijian教授がこの論文の共同責任著者であり、共同筆頭著者はYao Ke博士とHong Gaoying博士です。

図1 強靭なハイドロゲル足場の作製方法と特徴。研究者らはまず、3Dプリントにより多孔質でカスタマイズされた構造を持つハイドロゲル足場を作製し、その後、訓練中に硫酸アンモニウム溶液中でハイドロゲルを繰り返し伸ばしました。塩析によって相分離が行われ、硫酸アンモニウムが水分子の位置を置き換え、ハイドロゲル足場の表面と内部に方向性のある微細構造を形成し、ハイドロゲル分子鎖の整然とした配列を促進します。次に、ハイドロゲルを PBS 溶液に入れてプレストレッチを解除し、ハイドロゲルから硫酸アンモニウムを放出して、ハイドロゲルスキャフォールドの生体適合性を確保しました。研究者たちは数回の訓練を経て、機能的な表面構造を持つ強力なハイドロゲル足場を構築した。

図2 強靭なハイドロゲルの製造プロセスと性能の概略図。さらに研究者らは、硫酸アンモニウム溶液中での引張訓練中のハイドロゲル足場の強化メカニズムを研究した。荷電残基間の相互作用により特異性がもたらされます。トレーニングプロセス中、ハイドロゲル分子鎖の結合順序は、結合した物質の電荷強度に関係します。硫酸アンモニウムイオンは最も高いイオン強度を持ち、最初に親水性分子鎖に結合します。そのため、ストレッチトレーニング中、H2O は SO42− 配位によって強化されます。これは、結合エネルギーが配位の強化結合エネルギーよりも低いためです。伸張プロセスが継続すると、分子鎖は伸張応力の作用によりさらにコンパクトになり、伸張方向に沿って配向されます。 SO42−の配位エネルギーが水分子の配位エネルギーよりも高い場合、分子鎖に元々結合していた水分子はSO42−に置き換えられます。イオン強度と結合エネルギーの変化により、水分子は徐々に GelMA 分子鎖から解離し (図 3i)、密度が増加してハイドロゲルスキャフォールドの強化プロセスが実現します。研究者らは分子動力学を通じて上記の見解をさらに検証した。要約すると、高度に配向した分子鎖と高密度の分子鎖ネットワークが相乗的にハイドロゲル足場の機械的特性を高めます。

図 3 強靭なハイドロゲルスキャフォールドの強化メカニズム。研究者らは、ハイドロゲルスキャフォールドのトレーニング中に、異なる伸張率がトレーニング効果に影響を与えることを発見しました。延伸初期においては、延伸倍率が大きくなるにつれて、延伸方向に沿って配列する分子鎖の効果が顕著となり、強化効果がより顕著になります。しかし、伸張率が大きすぎると、ハイドロゲル繊維が破損し、微細構造の欠陥が生じ、ハイドロゲル足場の機械的特性に影響を及ぼす可能性があります。最終的に研究者らは、100% が最適な伸張率であると判断しました (図 4)。その後、研究者らは、この強靭なハイドロゲル足場が分解時間を大幅に延長し、組織修復の期間と一致させることができることを検証した。また、トレーニング後には硫酸塩成分がほとんど含まれなくなり、生体適合性が確保されます。

図 4 強靭なハイドロゲルスキャフォールドの印刷可能性と伸張率の影響。興味深いことに、この戦略では、塩の種類を変更することで、人間の組織の機械的特性を模倣した 10 kPa ～ 10 MPa の機械的特性を持つ強靭なハイドロゲルスキャフォールドを生成できます。また、ゼラチンやシルクフィブロインハイドロゲルなどの多くのハイドロゲルは、この戦略によって改善され、機械的強度や破壊延性が大幅に向上します。

図 5 調整可能な機械的特性を持つ強靭なハイドロゲル。細胞実験では、強靭なハイドロゲルスキャフォールドは生体適合性が優れているだけでなく、細胞接着を大幅に促進できることが示されています。そして、4日以内にC2C12細胞の方向性成長を効果的に誘導することができます。

図 6 強靭なハイドロゲルスキャフォールドの生体適合性に関する動物実験では、スキャフォールドが 4 週間以内に新世代の筋繊維、血管、神経の生成を効果的に促進し、大量の筋肉損失損傷の急速な再生を促進できることが示されました。

図7 手術後2週間および4週間における各グループの再生筋肉の組織学的分析図8 手術後2週間および4週間における各グループの再生筋肉の免疫組織化学分析記事出典:
https://link.springer.com/article/10.1007/s40820-024-01524-z

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