3DバイオプリントされたHif1a過剰発現BMSCハイドロゲルを使用した骨折治癒の促進

出典: EngineeringForLife

骨折は一般的な外傷性骨損傷であり、重要な臨床的意義を持ち、患者の生活に深刻な影響を及ぼします。伝統的な治療法は、場合によっては良い結果をもたらすことがあります。しかし、複雑な骨折や治癒に長期間を要する骨折の治療には、依然として課題と限界が存在します。

最近、同済大学医学部の主任医師である陳愛民氏は、北部戦区総合病院の海金医師、上海長征病院の朱磊医師のチームと共同で、骨折治癒中の軟骨マトリックスに対する低酸素誘導因子1α（Hif1a）遺伝子の調節効果を調査するためにGBMA@BMSCsハイドロゲル（GBMA、ゼラチンメタクリロイル骨マトリックス無水物、BMSC、骨髄間葉系幹細胞）を構築し、骨折治療におけるこのハイドロゲルの潜在的価値も調査しました。

関連する研究結果は、2024年11月24日に「3DバイオプリントHif1a過剰発現BMSCハイドロゲルによる骨折治癒の促進：骨修復の加速への新たなアプローチ」というタイトルでAdvanced Healthcare Materialsに掲載されました。

1. 生物培養に適した光架橋BMAハイドロゲルマトリックス材料の調製 脱細胞化骨組織材料の製造プロセスを図1Aに示します。無細胞骨組織材料を、それぞれ Triton X100 と DNase I で 12 時間および 24 時間処理しました。 H&E染色、マッソン染色、フィブロネクチンとコラーゲンの免疫染色の結果から、トリトンX100とDNase Iで12時間処理することが骨組織の脱細胞化に適していることが示された（図1B）。脱細胞化組織中の DNA 含有量は 96% 以上減少し ( 図 1C )、硫酸化 GAG (sGAG) 含有量 ( 図 1D ) とコラーゲン含有量 ( 図 1E ) は元の組織と同じでした。リアルタイムのその場光学フロー解析により、BMA せん断貯蔵弾性率の時間的変化が明らかになり、さまざまなせん断条件下での材料の機械的安定性が反映されました (図 1F)。さらに、異なる架橋時点での BMA 弾性率の分析により、BMA 弾性率は架橋時間の延長とともに大幅に増加することが示され、材料の機械的特性は架橋時間の延長とともに向上することが示されました (図 1G)。

BMAのSEM像は、I型コラーゲンに似た典型的な原線維構造を示した（図1H）。メタクリレート基との架橋後、BMA は共有結合で架橋されたハイドロゲルによく見られる多孔質の微細構造を示し、架橋度が増加するにつれて孔サイズは徐々に小さくなります。 BMA ハイドロゲルと共培養した分離済みの BMSC で細胞生存率アッセイを実施したところ、すべてのサンプルで少なくとも 5 日間培養した後でも細胞生存率が高いレベルで維持されていることが示されました (図 1I)。 5日目に、15、30、45秒間架橋されたBMSCの平均生存率はそれぞれ92％、94％、91％であり（図1J）、BMA材料の良好な細胞適合性が確認されました。これらの結果は、生体培養可能な光架橋 BMA ハイドロゲルマトリックス材料が正常に調製されたことを示しています。

図1 BMAベース材料の調製と特性
2. 複合ハイドロゲルの作製と細胞バイオプリンティング性能の研究 機械的特性と細胞の生存率を確保しながら 3D プリントを実現するために、研究者らは合成 BMA と市販の GelMA を組み合わせることを選択しました。次に、複合ハイドロゲルの 3D プリント成形性、機械的特性、および細胞生存率を研究しました (図 2A)。架橋前後のバイオインクの光学画像では、BMA 濃度が増加すると粘度が増加し、透明度が低下することが示されました。 BMAと混合した後、ハイドロゲルの内部形態は粗くなった（図2B）。レオロジー分析により、すべての複合ゲルがせん断減粘挙動を示すことが示されました。BMA 濃度が高いほど粘度が高くなり、ハイドロゲルの安定性は良好でした (図 2C-E)。さらに、BMA を添加すると、複合ゲルの圧縮弾性率が大幅に増加しました (図 2F)。架橋後、複合ゲルの膨潤率はBMA含有量に反比例して減少しました（図2G）。これは、BMA濃度が高いほど架橋点が密になり、ゲルの多孔性が低くなることを示しており、SEMの結果と一致しています（図2B）。分解実験では、BMAの添加により分解速度が加速されることが示された（図2H）。水接触角試験では、BMA含有量の増加とともに水接触角が減少することが示されました（図2I）。 BMA の添加により細胞の移動性が向上し (図 2J)、生細胞/死細胞アッセイでは UV 光架橋が細胞に優しいプロセスであり、重大な細胞死を引き起こさないことが実証されました (図 2K-L)。

図2 バイオインクの調製と特性評価
3. 3DプリントされたGBMA@BMSCsハイドロゲルはラットの骨折治癒を促進する ラットの骨折治癒における 3D プリント GBMA@BMSCs ハイドロゲルの役割を研究するために、大腿骨中間部骨折内部固定モデルを構築し、治癒過程におけるハイドロゲルの治療効果を観察しました (図 3A-C)。骨折部位の動的観察により、GBMA@BMSCs 群は仮骨と骨形成を促進し、骨折部位に強固な橋を築き、優れた治療効果をもたらすことが示されました (図 3D)。手術後14日目のマイクロCT 3D再構成では、GelMA/BMSCsおよびGBMA@BMSCsハイドロゲル治療群では仮骨形成が多く、骨折間隔が小さいことが示されました（図3E）。また、骨量/総骨量（BV/TV）および骨梁厚（Tb.Th）が大幅に増加し、その中でもGBMA@BMSCsハイドロゲル治療群ではその効果がより顕著でした（図3F）。染色結果では、GelMA/BMSCsおよびGBMA@BMSCsハイドロゲル処理群では骨面積が増加し、軟骨面積が減少したことが示された（図3G-I）。生体力学的分析により、GelMA/BMSCs および GBMA@BMSCs ハイドロゲル治療が骨折治癒を促進することが示されました。GBMA@BMSCs ハイドロゲル治療群は脱細胞化マトリックスが豊富で、骨関連物質の基盤を提供し、骨折修復治療効果は GelMA/BMSCs ハイドロゲル群よりも顕著でした (図 3J-L)。

図3 GBMA@BMSCsハイドロゲル移植によるラットの骨折治癒への影響
4. ラットの骨折治癒におけるGelMA/BMSCsハイドロゲルT移植のメカニズムに関する研究：Hif1aは重要な制御因子である その後、研究者らは、GelMA/BMSCsハイドロゲルで治療した骨折ラットを採取し、トランスクリプトーム配列解析を行い、正常なラットと比較して骨折治癒に関与する主要な遺伝子を分析しました（図4）。結果は、Hif1a の発現が骨折治癒段階で著しく増加し、仮骨形成および骨形成中にピークに達し、骨折治癒後期に減少することを示しました。これは、Hif1a が GelMA/BMSC ハイドロゲル移植の骨折治癒プロセスにおける重要な因子である可能性があることを示しています。
図4 骨折治癒過程のバイオインフォマティクス解析における重要な要素
5. Hif1aは低酸素条件下で骨髄間葉系幹細胞の活性を高め、軟骨分化を促進する

骨折の治癒は、最初は低酸素環境で起こります。私たちは、トランスフェクトされたBMSCを常酸素状態と低酸素状態で培養し、Hif1aがBMSCに及ぼす影響を調べました（図5A）。 Hif1aは低酸素条件下でより容易に活性化され安定化されるため、Hif1a過剰発現のトランスフェクション効果は低酸素条件下でより良好であった（図5B-C）。細胞実験では、低酸素条件下では細胞活動が弱まり、Hif1a の過剰発現が低酸素条件下での細胞増殖を促進することが示されました (図 5D-E)。さらに、Hif1a の過剰発現は、正常酸素状態と低酸素状態の両方で ATP レベルを増加させました。ATP レベルの増加は低酸素状態でより顕著であり、これは Hif1a タンパク質の発現と一致していました (図 5F)。Hif1a 過剰発現群の乳酸含有量は有意に増加しました (図 5G)。化学的酸素要求量（OCR）は低酸素状態では減少したが、Hif1a過剰発現後にはわずかに回復した（図5H）。

図 5 Hif1a は低酸素状態で骨髄間葉系幹細胞の活性を高める低酸素状態での骨髄間葉系幹細胞の分化に対する Hif1a 過剰発現の影響を観察するために、P4 および P6 骨髄間葉系幹細胞を異なる誘導培地で培養した。骨形成誘導条件下では、骨芽細胞に分化したBMSCの数が減少し、Hif1aが過剰発現し、骨形成関連遺伝子ALP、Runx2、BMP2の発現が著しく減少した（図6A-C）。脂肪形成条件下では、Hif1aの過剰発現により、脂肪細胞に分化するBMSCの数が減少し、脂肪形成関連遺伝子LPL、aP2、およびPPAR-γの発現が著しく減少しました（図6D-F）。これは、Hif1aの過剰発現がBMSCの骨芽細胞と脂肪細胞への分化を妨げていることを示唆しています。軟骨形成誘導条件下では、Hif1aを過剰発現するBMSCsに分化した軟骨細胞の数が有意に増加し、軟骨形成関連遺伝子SOX9、Col2a1、およびAggの有意な上方制御を伴い（図6G-I）、BMSCsは低酸素条件下で軟骨形成分化に対してより感受性が高いことを示しています。

図6 低酸素下における骨髄間葉系幹細胞の分化誘導
6. 骨髄間葉系幹細胞におけるHif1aの過剰発現は軟骨細胞コラーゲンの安定性を高める 次に、研究者らは、単離した軟骨細胞を、Hif1aを過剰発現する骨髄間葉系幹細胞と共培養しました。軟骨関連遺伝子の発現は、骨形成遺伝子および脂肪形成遺伝子と比較して大幅に増加しました（図7A）。同時に、Hif1aの過剰発現は軟骨細胞の細胞活性を高めました（図7B-C）。さらに、Hif1aは軟骨細胞コラーゲンの安定性を高め、軟骨内骨化の進行を確実にしました（図7D-J）。

図7 Hif1aの共培養システムへの影響
7. Hif1aの過剰発現は軟骨T細胞の変化と骨折治癒を促進する
Hif1a は、軟骨内骨化や膜内骨化など、複数の骨格発達イベントを伴う再生プロセスである骨折治癒を促進します。研究者らは、骨髄間葉系幹細胞をoe-hif1aで処理し、oe-hif1a処理GBMA@BMSCsハイドロゲルを調製し、それを骨折したラットの骨髄腔に移植して治療し、ラットの骨折修復に対するoe-hif1aの効果を観察しました（図8）。 X線、組織学的評価、免疫蛍光染色、骨量/組織量、骨梁数の結果から、oe-hif1a群はより多くの軟骨組織を生成し、軟骨の変化がより早く始まり、より明らかな軟骨修復効果があり、治癒の中期および後期に血管再建を促進し、それによって新しい骨の形成を促進する可能性があることが示されました。

図 8 oe-hif1a 処理した GBMA@BMSCs ハイドロゲルのラットの骨折治癒への影響要約すると、本論文では、骨髄間葉系幹細胞とバイオニックハイドロゲル構築法を組み合わせた高度な生物学的 3D 印刷技術を使用して、骨折を治療するための革新的な方法を確立しました。従来の骨折治療法と比較して、この技術はカスタマイズ性、高い生体適合性、3D構造の複雑さといった利点があります。

ソース：
https://doi.org/10.1002/adhm.202402415

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