迅速な DNA 分離のための新しい 3D プリントマイクロ流体磁気プラットフォーム

分析化学から転載

生物学的サンプル、特に生物学的情報保存分子としてのデオキシリボ核酸 (DNA) の精製または分離は、多くの遺伝学研究、法医学、希少疾患の臨床診断、癌診断、および/またはウイルス性疾患の重要な出発点です。これまで、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、アルカリ抽出、塩析、ろ紙、シリカマトリックス（ゲル、樹脂、またはミクロスフェア）、磁気ビーズ（パックカラム、重力カラム、スピンカラム、スピンプレート、磁気スタンドとして市販されている）など、さまざまな技術がDNAの分離に便利に使用されてきました。

従来の方法と比較して、マイクロ流体システムは、実験室規模のアプリケーション向けに小型化を実現し、数マイクロメートルまたはナノメートルでの操作を可能にし、精度の向上、分析時間の短縮、交差汚染のリスクを最小限に抑えながら分離プロセス全体の信頼性の向上を実現します。マイクロスケールで流体を正確に制御する能力により、連続フロープロセスやマイクロ流体システムにおいて、バッチトップデバイスをチャネル、バルブ、ポンプ、ミキサー、センサーなどのさまざまな機能コンポーネントに置き換える多くの可能性が開かれます。

本研究では、らせん状マイクロ流体デバイス内での迅速な DNA 分離のために超常磁性ビーズを操作する革新的なソリューションとして、新しい磁気プラットフォームを提案しました。プラットフォーム上の永久磁石の配置と回転を評価するための計算モデルが構築されました。

研究内容 超常磁性シリカ微粒子（1 mg）をPDMベースのマイクロ流体チップに充填しました（図1D）。粒子を搭載したマイクロ流体チップを磁気プラットフォーム上に配置しました（図 1A）。磁場は、マイクロ流体チップの下の磁石の回転によって生成されます。シリンジポンプは、所望の流量（5〜20 μL/分）でバッファーをマイクロ流体デバイスに送り込みます。各実験の開始時に、6 M Gu-HClを含む結合媒体1×TE（10 mM Tris、1 mM EDTA）緩衝液（pH 6.0）で20 μL/分の速度で2分間洗浄することにより、分離システムを準備しました。 DNA 分離は主に (i) 吸着、(ii) 洗浄、(iii) 溶出の 3 つのステップで行われます。

図 1 (A) CAD モデルと 3D 印刷プラットフォーム、(B) プラットフォームの CAD 分解図、(C) PDMS 成形用の金属金型、および (D) マイクロ流体チップ (コイン直径 26.15 mm)。
5、2、1 μmのバーのSEM像（それぞれ15,000、30,000、80,000倍）では、磁性シリカ粒子は球形で単分散の形態をしており、大きさは約6 μmでした（図2B）。表面の化学組成には、O、Si、Fe原子が含まれており、その重量はそれぞれ51.03、33.02、15.95%です（図2B）。 FTIR スペクトルは、図 2C に示すように、磁性シリカビーズの化学構造を示しています。 1060 cm−1のピークは構造中のSi−O−Si結合を表します。 630、570、440 cm−1の吸収帯は鉄ナノ粒子（Fe−O伸縮）に属します。 6 粒子の磁気特性は、VSM解析によって得られたヒステリシス曲線によって評価された（図2D）。ヒステリシス曲線は超常磁性特性を示し、磁気飽和は約10 emu/gです。さらに、酸化鉄ナノ粒子でコーティングされたシリカ微粒子 (SPION) には保磁力のための永久磁化がありません。

図2 (A) 合成された磁性粒子の形態構造（SEM画像）、(B) 表面化学（EDX結果）、(C) 化学構造（FTIRスペクトル）、および(D) 磁気特性（VSM結果）。
マイクロ流体 DNA 分離のモデル DNA として、異なる濃度の魚精子 DNA とヒト胎盤 DNA の 2 種類の DNA が使用されました。まず、魚の精子 DNA を 1 ステップあたり 10 μL/分の流速で分離しました。分離は 30 分以内に完了しました (吸着 10 分、洗浄 8 分、溶出 10 分、シリンジ交換に約 1 分)。魚精子 DNA は pH 6.0 の結合緩衝液中の粒子に吸着されました。図3Aに示すように、吸着された魚精子DNAの量はDNA負荷量の増加とともに増加しました。一定量の DNA を超えると、吸着剤 (磁性シリカ粒子) は飽和点に達し、吸着分子 (DNA) を吸着しなくなり、最大吸着容量 (qm) に達します。吸着効率曲線は、実験的なqmが粒子1mgあたり約100μgであることを示しました（図3A）。 Sips 吸着モデルは、吸着プロセスの動作を理解するためにも使用されています。魚精子DNA吸着に関するSipsモデルの回帰係数（R2）は0.990でした。モデルのqm値は121μg/mgでした。吸着等温線モデルは、システムが化学吸着によって支配され、単層吸着プロセスとして考えられる可能性があることを示しました。ヒト胎盤 DNA を使用して、同じ条件 (各ステップの流量は 10 μL/分、結合バッファー pH は 6.0) でのシステムの吸着挙動を研究しました。 DNA サンプルを消費しない最大吸着量を決定するために、より高い濃度が選択されました (図 3B)。 qm は約 110 μg/mg であることがわかりました。これは、文献に記載されているいくつかのバッチシステムで使用されている磁性ナノ粒子 (16〜121 μg/mg) に匹敵します。 Sips モデルは、回帰係数が 0.998、qm が 109 μg/mg で実験データポイントに適合し、実験データとよく一致しています。脱着効率は、異なる pH 値の 1 × TE 緩衝液を使用して測定されました。実験は室温で流速10μL/分、魚精子DNAの溶出量100μLで3回繰り返した（図3C）。

結果は、化学的な相互作用も脱着プロセスにおいて主要な役割を果たすことを示しています。溶出バッファーの pH 値が 7.0 から 9.0 に増加すると、脱着効率も 18% から 38% に増加しました。

図3 (A) 魚精子 DNA と (B) ヒト胎盤 DNA の吸着。各流量（サンプル流量は10μL/分）において、3回の独立した反復実験の平均値が±標準誤差として示されました。 (C) 異なるpH値における魚精子DNAの脱着効率。実験は各 pH 値で 3 回繰り返されました (サンプル流量は 10 μL/分)。
モデル DNA として魚精子 DNA、結合バッファー pH 6.0、溶出バッファー pH 8.0 を使用して、分離ステップにおける流速の影響を調査し、DNA の分離に使用される同様の材料および方法と比較しました。この目的のために、流速5、10、20μL/分で実験を3回繰り返した。図4に示すように、吸着効率は流量に反比例し、流量10μL/分では吸着性能は約70％で飽和します。飽和に達すると、磁性粒子はそれ以上 DNA を結合することができなくなり、吸着効率が一定になります。流量が減少すると、マイクロチャネル内の DNA バッファーの滞留時間が長くなり、粒子表面と DNA 分子との接触時間に影響し、吸着速度と静電相互作用に影響を及ぼし、DNA 吸着が促進されます。さらに、微粒子への抵抗が減少し、DNA分子が微粒子に付着しやすくなりました。脱着性能を評価すると、流量の増加とともに脱着効率が上昇することがはっきりとわかります。流量が 20 μL/min の場合、脱着効率は約 75% に達します。これは、DNA 分子に作用する抗力が増加し、粒子表面からの剥離が促進されるためと考えられます。

シミュレーションでは、重イオンは垂直に入射し、MCD-FETとCAVETの最も敏感な位置は、どちらもpベースの右側にありました。図9の灰色の矢印で示されるように、pベースの近くに高電界領域がありました。最悪のシナリオを考えると、重イオンが装置全体を貫通することになります。図4は、オフ状態（VDS = 100 V、VGS = 0 V）におけるMCD-FETとCAVETのIDSの時間変化を示しています。 MCD-FET と CAVET の両方の IDS は電流ピーク値 (Ipeak) まで上昇し、その後徐々に減少します。 CAVET と比較すると、MCD-FET は 10.11 mA の低いピークを示し、64.9% の削減となります。

図4 異なる流速におけるプラットフォームによる魚精子DNAの吸着、脱着および分離効率。値は、各流量での 3 つの独立した反復実験の平均 ± 標準誤差です。
DNA を迅速に分離するには、全体の処理時間を最小限に抑える必要があります。吸着効率は5μL/分で最適であり、脱着効率は20μL/分で最適であった。 10 μL/分での吸着効率も5 μL/分での吸着効率に近かった。処理時間が短い最適な操作条件では、吸着ステップサイズは 10 μL/分、洗浄および脱着ステップサイズは 20 μL/分、操作時間は 10 分 (吸着に 5 分、洗浄に 2 分、溶出に 3 分) で、分離効率は 50% 以上に達することができました。

表 1 は、当社のプラットフォームのさまざまな側面と文献に記載されている他の技術との比較を示しています。

表 1 文献に記載されているさまざまな DNA 分離方法の比較当社のプラットフォームよりも分離効率の高い方法もありますが、サンプル数、ロードされたサンプル数、および処理時間を考慮すると、当社のプラットフォームの方がパフォーマンスが優れています。しかし、特に脱着プロセスにおいては、まだ改善の余地があります。文献では、溶出緩衝液中の塩の量を1 Mに増やし、高温でリン酸緩衝液を使用することで脱着効率を向上させる研究があります。したがって、当社のプラットフォームの脱着性能をさらに強化することができ、分離効率が向上します。さらに、当社のスパイラルマイクロチャネルの容積は 40 μL であり、処理時間に影響します。マイクロチャネルの容量、チャネルの寸法、流量を最適化することで、処理時間をさらに短縮し、迅速な分離を実現できます。当社のプラットフォーム設計は非常に柔軟性が高く、実際に、処理するサンプルの数に応じてマイクロチャネルの形状を最適化できます。

要約と展望<br /> この研究では、迅速な DNA 分離のための 3D プリントされたマイクロ流体磁気プラットフォームとして、新しい小型デバイスが提案されました。この斬新な設計により、らせん状のマイクロチャネル内で磁性粒子を連続的に流すことができます。磁気的に粒子を操作することの有効性を評価するための計算モデルが開発されました。

自社で合成した超常磁性単分散シリカ粒子を使用して、魚の精子と胎盤 DNA を分離しました。プラットフォームの吸着、脱着、分離効率は包括的な実験を通じて評価されました。私たちの実験では、当社のプラットフォームでは DNA 分離が 10 分以内に完了できることが示されました。

最近、私たちのグループは、マイクロ流体チップにサンプルをロードするためのフレキシブル油圧リザーバー (FHR) を開発しました。バルブを内蔵した FHR の新バージョンが開発中です。新しいバージョンの FHR を実装すると、処置中に注射器を交換する必要がなくなり、最終的にはプロセス全体が完全に自動化されます。さらに、当社のプラットフォームは柔軟な設計になっており、特定の用途に応じて FHR とマイクロチャネルの容量を変更することができます。

したがって、サンプル数に関する柔軟な設計、迅速な分析、比較的複雑でない機器への依存、低コストの製造、そして最も重要な、ポータブルなポイントオブケア検査の可能性などの優れた機能を考慮すると、当社のプラットフォームは低コストで迅速な DNA 分離のための実行可能なオプションです。分離効率をさらに向上させ、当社のプラットフォームを細菌、ウイルス、エクソソームなどのさまざまな生体材料の分離に適用することが、当社の将来の研究方向の一部となります。

論文情報: Gnes Kibar、Buigra Sartarslan、Serkan Doganay、Gokay Yildiz、O. Berk Usta、Barbaros Cetin。
論文リンク: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04412

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