AFM: 灌流可能なネットワークを持つ異種ハイドロゲルのマルチマテリアル DLP バイオプリンティング

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

生体組織や臓器の複雑な異質性を模倣する in vitro モデルを確立することは、研究者の生物学的メカニズムの理解を深め、組織工学や再生医療のための新しい薬剤や治療法を開発する上で非常に重要です。押し出しや単一材料ベースのデジタル光処理 (DLP) バイオプリンティングなどの従来のバイオプリンティング手法では、自然組織の複雑な機械的および構造的多様性を捉えることができません。

この問題を解決するために、深セン大学の孟思准研究員と孔天田教授のチームは、マルチマテリアル DLP バイオプリンティングと PEGDA-AAm (略して PA) バイオインクを組み合わせて、マルチコンポーネント、マルチモジュール、細胞充填ハイドロゲル構造を開発しました。これらの構造は、不均一な機械的特性を備えているだけでなく、複雑な構造と精密に設計された表面微細構造も備えています。

関連する研究成果は、2024年4月8日に「灌流可能なネットワークを備えた不均一なハイドロゲル構造のマルチマテリアルデジタル光処理（DLP）バイオプリンティング」というタイトルでAdvanced Functional Materialsに掲載されました。

ハイドロゲル構造を印刷するために、DLP ベースのプリンターを使用して、波長 405 nm、最大光強度 ≈ 100 mW cm−2 の LED 光源でハイドロゲル前駆体 (図 1) を固化しました。 DLP プリンター用のバイオインクを調合するために、研究者らは、ハイドロゲルの柔らかい構造成分と硬い構造成分としてそれぞれ AAm と PEGDA を使用してハイドロゲル前駆体を調製しました。この配合では、リチウムフェニル 2,4,6-トリメチルベンゾイルホスフィネート (LAP) が光開始剤として使用され、赤色食品色素が光吸収剤として使用されました。

図 1 異種ヒト組織構造を模倣するための in vitro モデルとして使用されるハイドロゲル構造の概略図。バイオインクのゲル化時間 (Tgel) は印刷性に大きく影響します。研究者らは、濃度 25、35、50 wt% の PA バイオインクサンプル 1 mL をガラスバイアル内で 10 秒間光架橋しました。結果は、濃度 25 および 35 wt% の PA バイオインクは部分的なゲル化しか示さなかったのに対し、濃度 50 wt% の PA バイオインクは完全にゲル化して固化し、インクの流れはほとんど見られなかったことを示しました。これは、50 wt% PA バイオインクの方が硬化プロセスが速く、複雑な構造を作成するのに適していることを示しています (図 2A)。レオロジー試験と弾性率計算により、モノマー濃度 50% の PA バイオインクが印刷性の向上に最も適した候補となり (図 2B-C)、その後の実験の第一選択肢となることも示されました。さらに、研究者らは、露光パラメータ、光吸収剤含有量（最適比率は1％）、モノマー濃度、PEGDA：AAm（PA）比率（それぞれ2％、5％、10％）を最適化し、水性環境下で優れた構造完全性と寸法完全性を示すin vitroモデル構築された足場材料を得ました（図2D-I）。細胞実験では、軟質および硬質PAハイドロゲルはともに、I型コラーゲンで表面処理した後、優れた生体適合性を示し（図2J-L）、細胞の成長をサポートするマトリックス材料として大きな可能性を秘めていることが示されました。

図 2 ハイドロゲルバイオインクの物理的特性、印刷性、細胞生存率灌流可能なネットワークを備えた細胞充填ハイドロゲル構造の製造における DLP バイオプリンティングの可能性を実証するために、研究者らは直線状の気管のようなチャネルを備えたマイクロ流体チップを作成しました。構造内の中空チャネルの印刷が成功したことを確認するために、研究者らは青色蛍光を発する NIH-3T3 細胞をこれらのチャネルに注入しました (図 3A)。この論文では、埋め込まれた中空構造を持つ 2 つの異なるハイドロゲル構造の構築に成功したことを示しています (図 3B、E)。共焦点顕微鏡を使用すると、バイオインクに混合された Hela-GFP 細胞がハイドロゲル全体に均等に分散され、灌流された NIH-3T3 細胞が中空のチャネルを満たし、その青色蛍光がこれらの埋め込まれたマイクロチャネルの輪郭をはっきりと示していることがわかります。それぞれ特定の領域に局在する緑色蛍光 Hela-GFP 細胞と青色蛍光 NIH-3T3 細胞間の明確な区別 (図 3C、D、F、G) は、コンストラクトの高い忠実度を実証しています。

ハイドロゲル構造の表面トポロジーは細胞の挙動に影響を与える上で重要な役割を果たすため、特定の表面トポロジカル微細構造を持つハイドロゲル構造を作成することが非常に重要です (図 3H)。これらの表面トポロジカル微細構造が細胞の挙動に与える影響を評価するために、研究者らは、らせん溝微細構造と三周期極小表面 (TPMS) に基づく微細構造の 2 種類を設計しました。螺旋溝微細構造は、平滑筋細胞や間葉系幹細胞などの細胞の方向を誘導するのに特に効果的です。一方、TPMS は、中断のない連続した表面を提供する反復的で組織化されたパターンで知られています (図 3I-P)。

図 3 灌流可能なネットワークと設計された表面トポグラフィーを備えた細胞を含んだハイドロゲル構造肝小葉、皮膚、軟骨などの組織や臓器に固有のさまざまな機械的係数を再現することは、組織工学における課題です。マルチマテリアル DLP テクノロジーと多機能 PA バイオインクを使用して、異なる機械的特性を持つコンポーネントを単一の in vitro モデルに堅牢に組み立てました。簡単な例としては、PA1 と PA2 ハイドロゲルの統合が挙げられます。ここでは、間隙空間に存在する未硬化 PA バイオインクの固化によって界面での結合が実現されます (図 4A)。同じサイズだが配合が異なる2つのハイドロゲルを組み合わせると、中間のバランスの取れた機械的特性を持つハイドロゲルが得られました（図4B）。より複雑な例では、PA1 および PA3 バイオインクを同じ平面上に事前に設計されたパターンで印刷し、それらを相互接続して、PA1 ハイドロゲルが PA3 ハイドロゲルの伸張を効果的にサポートし、界面での破裂や分離が発生しないようにしました (図 4C)。

生物学的に重要な異種組織モデルの製造におけるマルチマテリアル DLP の能力を実証するために、青色 PA1 バイオインクと赤色 PA3 バイオインクを使用してそれぞれ類洞と板を表す、簡略化された肝小葉モデルが開発されました (図 4D)。印刷後に撮影された光学画像では、異なる機械的弾性率を持つ青色と赤色のハイドロゲルの境界が明確に示されました (図 4E)。さらに、蛍光顕微鏡検査により、NIH-3T3 細胞と Hela-GFP 細胞が指定されたハイドロゲル領域内に均等に分布していることが示され (図 4F)、複数の材料構造内で複数の細胞タイプを領域特異的にカプセル化することが効果的に達成されました。多成分モデルの作成に成功したことは、この方法がハイドロゲル材料内の細胞相互作用を研究する上で潜在的可能性を示唆しています。さらに、研究者らは異質性の探究を Z 軸まで拡張し、Z 軸に沿って異質構造を構築する可能性を実証しました (図 4G-M)。

図 4 細胞が充填された多材料異種ハイドロゲル構造要約すると、この論文では、細胞が充填されたハイドロゲルマイクロ流体デバイスの製造方法を示し、表面トポロジー (らせん状の溝や三周期極小表面を含む) が細胞の挙動をどのように導くかを探ります。このアプローチは、体外で組織や臓器の構造を複製するための新たな道を開きます。複合およびデュアルネットワークハイドロゲルの進歩と、マルチマテリアル DLP バイオプリンティングによる精密な構造の複製能力を統合することで、骨組織の構造の複雑さと機械的挙動を正確に模倣する上で大きな進歩が実現する可能性があります。この研究は、in vitro モデルとしての応用に加えて、血管組織工学と再生医療への洞察も広げ、特にこれらのバイオプリント材料をインプラントとして使用することの可能性を強調しています。

ソース：
https://doi.org/10.1002/adfm.202316456

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