感染した骨の欠損を治療するために、金属ポリフェノールナノ粒子と組み合わせた 3D プリント自己硬化型生体模倣海綿骨セラミックベースの足場

出典: EngineeringForLife

感染性骨欠損は、微生物感染によって引き起こされる骨損傷または欠損の一種であり、重度の汚染骨折または血液媒介感染によって引き起こされることが多い。現在、感染性骨欠損の臨床治療は、主に感染制御と骨欠損再建によって行われている。その中で、細菌を抑制する抗生物質骨セメントの使用と骨移植修復技術は、最も一般的に使用される治療法であるが、細菌耐性の増加や骨セメントの二次除去の必要性などの問題があった。そのため、組織工学技術による抗感染効果と骨形成効果の両方を備えた生物学的足場の調製は、このような疾患を解決するための研究のホットスポットです。

最近、四川大学の銭志勇教授と劉先教授のチームは、臨床での骨セメントの硬化性能にヒントを得て、α-リン酸三カルシウム（α-TCP）、β-リン酸三カルシウム（β-TCP）、ゼラチン、ポリビニルアルコール（PVA）を使用してバイオインクを構築し、低温3Dプリント技術を使用して、自己硬化機能を備え、海綿骨の構造と組成を模倣した人工骨スキャフォールドを準備し、金属ポリフェノールネットワーク構造を持つ茶ポリフェノールマグネシウム（TP-Mg）ナノ粒子を充填して、骨誘導能力、抗菌特性、抗炎症特性を実現し、感染性骨欠損の問題を相乗的に解決しました。この論文の第一著者は、成都大学の胡旭林博士と四川大学華西口腔病院の陳嬌博士です。論文作成にご協力いただいた重慶医科大学の楊淑豪師、成都大学の呉昊明師、河南科技大学の何建博士に感謝いたします。また、ご協力いただいた EngineeringForLife (EFL) チームにも感謝いたします。使用したプリンターモデルは EFL-BP-6601 です。関連研究は「感染性骨欠損の修復のための TP-Mg ナノ粒子と組み合わせた 3D プリント多機能生体模倣骨スキャフォールド」というタイトルで Small 誌に掲載されました。
図1 研究プロセスの模式図本研究では、自己硬化特性を持つα-リン酸三カルシウム（α-TCP）を使用してβ-リン酸三カルシウム（β-TCP）を配合し、低温3Dプリントでバイオニック海綿骨スキャフォールドシステム（α/β-TCP）を構築し、スキャフォールド内にゼラチンを有機相として保存し、金属ポリフェノールネットワーク構造を持つTP-Mgナノ粒子を充填する方法を提案しました。感染性骨欠損の初期の微小環境を調整しながら、後期の骨再生と治癒を促進し、感染性骨欠損の治療に優れた応用の見通しがあります（図1）。

図 2 金属ポリフェノールナノ粒子とバイオインクの特性評価まず、著者らは、透過型電子顕微鏡画像 (図 2A)、ゼータ電位テスト (図 2B)、およびフーリエ変換赤外分光法 (図 2C) を通じて TP-Mg ナノ粒子の調製を検証しました。 α-TCP の硬化特性を検証するために、著者らはバイオインクをボトル内で反転させ、その流動特性を観察しました。適切な印刷条件とバイオインク比率を探るために、著者らは、異なる印刷温度と異なるα-TCP含有量でのインクの押し出し性能について議論しました。最終的に、α-TCP含有量が0%～30%のバイオインクは、印刷温度範囲（15℃～30℃）内でうまく押し出せることがわかり、インクの印刷性はレオロジーによってさらに検証されました。

図3 複合スキャフォールドのマクロおよびミクロ形態と基本性能特性。図3Aは、3Dプリントされた複合セラミックススキャフォールドのマクロ写真を示しています。走査型電子顕微鏡（図3B）では、マクロポーラス構造が観察されました。同時に、よりミクロな視点では、α-TCPがβ-TCP無機塩粒子の表面と相互接続されたゼラチンネットワーク構造で水和していることがわかりました。これにより、海綿骨のマクロおよびミクロ構造と構成のマルチレベルバイオニクスが実現しました。さらに、α-TCP から CDHA への相転移が XRD によって検証され (図 3C)、その後、著者らはスキャフォールドの多孔性、吸水性、表面粗さ、および親水性を特性評価しました (図 3E-H)。

図4 複合スキャフォールドの機械的特性、ミネラル化挙動および劣化挙動。高温で焼結されたセラミックススキャフォールドは脆性破壊を起こすことが多いが、低温3Dプリント技術ではスキャフォールド内部に有機相が保持されるため、高強度圧縮下でも脆性破壊が起こらない（図4A）。同時に、著者らは、α/β-TCPスキャフォールドの機械的強度はα-TCPの比率と正の相関関係にあることを発見した（図4B）。また、スキャフォールドの機械的強度は水和時間（1、3、6時間）とともに徐々に増加し、最終的に100 MPaを超える（図4D）。薬物放出実験でも良好な薬物放出挙動が示されました (図 4E)。さらに、著者らはスキャフォールドのミネラル化および分解挙動を検証した（図4F-H）。

図 5 複合スキャフォールドの生体適合性の評価複合スキャフォールドの良好な生体適合性は、細胞生死染色、CCK-8 分析、および走査型電子顕微鏡による細胞接着挙動を通じて観察されました (図 5A-D)。また、30α/β-TCP@50TP-Mg スキャフォールドが細胞増殖に対して一定の阻害効果を持つことも観察されました。

図 6 複合スキャフォールドの in vitro 骨形成効果 in vitro ALP およびアリザリンレッド実験では、30α/β-TCP@10TP-Mg グループが最も顕著な染色結果を示したことが観察されました (図 6A-C)。異なる期間における骨形成遺伝子の発現を検出することにより、30α/β-TCP@10TP-Mg グループのスキャフォールドが安定した骨形成効果を持つことも判明しました (図 6D)。これは、TCP 無機塩スキャフォールド内の Ca2+ と TP-Mg ナノ粒子内の Mg2+ の相乗効果によるものと考えられます。

図 7 複合スキャフォールドによるマクロファージ分極の in vitro 制御感染性骨欠損は、しばしば強い炎症環境を伴います。著者らは、リポ多糖 (LPS) でマクロファージを刺激して M1 に分極させ、複合スキャフォールドと共培養しました。その結果、スキャフォールドから放出された TP-Mg が M1 マーカー CD86 および INOS の発現を効果的に減少させ、M2 マーカー CD206 の発現を促進することがわかりました (図 7C-D)。 PCRおよびウエスタンブロットタンパク質分析でも、30α/β-TCP@10TP-Mg群による処理後にINOS発現のダウンレギュレーションとアルギナーゼ-1（ARG-1）発現のアップレギュレーションが観察されました（図7E-F）。

図 8 複合スキャフォールドの in vitro 抗菌特性感染した骨欠損部における細菌の効果的な殺菌という問題を解決するために、著者らは、走査型電子顕微鏡下での細菌の生死画像およびスキャフォールドと細菌の共培養によって、黄色ブドウ球菌に対する TP-Mg の効果的な阻害を検証しました (図 8A-B)。次に、培養後の OD600 および ROS レベルを測定することによって細菌の増殖を調べました (図 8D、E)。結果は、30α/β-TCP@10TP-Mg および 30α/β-TCP@50TP-Mg との共培養後、黄色ブドウ球菌の増殖が制限され、ROS 産生が大幅に増加することを示しました。

要約すると、著者らは臨床的観点から感染性骨欠損の特徴と現在の問題について説明しています。私たちは低温 3D プリント技術を使用して、骨欠損に対して十分な機械的強度と骨伝導特性を提供できるバイオニック骨セラミックスキャフォールドを準備しました。さらに、TP と Mg の自己組織化ナノ粒子を充填することで、抗炎症、抗菌、骨誘導特性を備えた α/β-TCP@TP-Mg 複合セラミックススキャフォールドを構築しました。研究結果によると、α/β-TCP@TP-Mg複合スキャフォールドは生体適合性が良好で、骨形成能に優れ、抗炎症および抗菌活性があることがわかりました。また、ラットの感染した骨欠損モデルにおいても有望な修復効果を示しました。この新しい医療製品は、二次手術や抗生物質の過剰使用を必要とせずに感染した骨欠損の正確な治療を実現する可能性を秘めており、感染した骨欠損の治療の探求にさらに豊かな研究内容を提供します。

ソース：
https://doi.org/10.1002/smll.202403681

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