華南理工大学の曹暁東氏のチーム：軟骨再生のための幹細胞を搭載した3Dプリントシルクフィブロイン/ゼラチン足場

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

関節軟骨組織は、スポーツによる傷害や疾患を一度負うと、自然治癒が困難です。軟骨欠損の治療法として、現在、骨髄刺激法、自家骨軟骨移植法、マトリックス誘導自家軟骨細胞修復手術法などが用いられていますが、これらの治療法には、ドナー不足や線維軟骨再生などの問題が残っています。したがって、軟骨の損傷を効果的に修復する方法は依然として大きな課題となっています。最近、華南理工大学の曹暁東教授のチームは、押し出し低温3Dプリント技術を使用して、シルクフィブロイン（SF）とチラミン修飾ゼラチン（GT）の西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）媒介架橋を介して多孔質ハイドロゲルスキャフォールドを調製し、幹細胞凝集体接種と組み合わせて、II型コラーゲンの高発現、硝子軟骨への分化を促進し、関節軟骨の再生と修復効果を高めました。関連論文「異なる多孔質構造と軟骨再生のための細胞播種戦略を備えた 3D プリントされたシルクゼラチンハイドロゲルスキャフォールド」が、Bioactive Materials 誌に掲載されました。

まず、研究者らは、3Dプリント技術を活用し、ゼラチンの感熱性と過酸化水素浸漬によるゲル化法を組み合わせることで、相互接続された細孔構造を持つ3Dプリントハイドロゲル足場を準備しました（図1）。また、光学顕微鏡と走査型電子顕微鏡（SEM）を使用して、3Dプリントハイドロゲル足場の表面と断面の形態を評価しました（図2）。

図 1 3D プリントハイドロゲルスキャフォールドの合成の概略図図 2 3D プリントハイドロゲルスキャフォールドの表面および断面画像 SF-GT ハイドロゲルの機械的特性を分析するために、研究者らはフーリエ変換赤外分光法 (FTIR) と圧縮実験を使用して、3D プリントハイドロゲルスキャフォールドが優れた圧縮および疲労耐性を備え、組織工学軟骨のサポート役を果たすことができることを確認しました (図 3)。

図3 3Dプリントされたさまざまなハイドロゲル足場のFTIRスペクトル。その後、研究者らはシルクフィブロインを添加して分子構造の変化を誘導することで、高い多孔性を維持しながらハイドロゲルの機械的特性を改善し、分解時間を延長しました。さまざまな物理的および化学的性能試験により、SF5GT15 /アルコール処理された足場が軟骨組織の再生に最も適した足場材料であることが示され、生死染色法を使用してSF-GTハイドロゲル足場が優れた生体適合性を持っていることが検証されました（図4）。

図4 異なるハイドロゲル足場の物理的および化学的特性試験。次に、研究者らは、貫通穴（TH）と千鳥穴（SH）を備えた2つの足場を開発しました。実験結果によると、足場内の繊維フィラメントの空間配置を変更することで、千鳥穴足場と貫通穴足場をうまく印刷できることが示されました。2つの足場の多孔度と機械的特性には大きな違いはありませんが、千鳥穴により細胞播種の効率が向上します（図5）。

図5 ハイドロゲルスキャフォールドの内部構造のSEMスキャン。次に、研究者らは、細胞懸濁液（CS）と細胞凝集体（CA）という2つの細胞播種方法を比較し、細胞凝集体播種は細胞をスキャフォールドに効果的に浸透させ、構造全体で細胞の空間分布を実現し、高品質のマトリックス組織を形成できることを発見しました（図6）。in vitro軟骨誘導実験では、同じ誘導条件下で、細胞凝集体播種は円形の幹細胞の凝集を維持し、幹細胞がより多くのII型コラーゲンを発現・分泌し、幹細胞が硝子軟骨に分化することを促進することが示されました。一方、細胞懸濁液播種法では、幹細胞がより多くのI型コラーゲンを発現・分泌し、幹細胞が線維軟骨に分化する傾向があります（図7および8）。

図 6 細胞の生死染色図 7 CA/SH および CS/SH の in vitro 軟骨形成図 8 3D プリントされたハイドロゲルスキャフォールド上での CS および CA の軟骨分化最後に、研究者らは、ウサギの関節軟骨欠損モデルにおいて、幹細胞凝集体を充填した交互穴スキャフォールドが軟骨欠損の修復に及ぼす影響を評価し、12 週目と 16 週目の修復状態 (図 9) と複数の組織学的染色結果 (図 10) を比較しました。これにより、細胞凝集体を接種した交互穴スキャフォールドは、関節軟骨の再生と修復を効果的に達成できることが示されました。

図 9 in vitro 動物実験図 10 in vivo 再生軟骨の組織学的評価要約すると、本研究では、3D プリントされた SF-GT ハイドロゲルと幹細胞凝集体を組み合わせることで効果的な軟骨組織工学法を開発し、高度にバイオニックな物理的および化学的特性を持つ軟骨組織工学スキャフォールドを構築し、組織工学軟骨の形成を評価するための in vitro 実験を設計しました。最後に、in vivo 研究では、細胞凝集体接種法で調製された 3D プリントされた SF5GT15 ハイドロゲルは、軟骨の再生と修復を促進する上で幅広い臨床応用の見通しがあることが示されました。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2021.03.013

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