3DプリントされたJanus異種マイクロスフィアは、全サイクルを通じて骨再生の放出を正確に制御します。

出典: EngineeringForLife

統計によると、世界中で毎年約200万件の骨移植手術が行われています。自家骨移植や同種骨移植は骨再生効果が良好ですが、ドナー部位の合併症やドナー源の制限などの問題により、手術の90％以上で依然として骨移植材料の使用が必要であり、そのため、現在、臨床現場では骨移植材料に対する需要が非常に高くなっています。天然の骨組織は主にリン酸カルシウムで構成されているため、既存の骨代替物は主にリン酸カルシウム材料に基づいており、カルシウムとリン酸の原料を欠損領域に直接供給することで骨誘導を実現します。しかし、文献によると、このタイプのリン酸カルシウムベースの材料は、体内に埋め込まれた後、患部と直接融合して骨を形成するのではなく、分解と再骨形成を通じて骨の再生を促進します。同時に、その分解速度は低く、長期的な空間占有も新しい骨の効果的な再構築に影響を与えます。したがって、成熟した骨組織の主な化学成分を骨代替物の主成分として使用するこのトップダウン戦略には、骨形成効率が低く、新しい骨の効率的な再生に影響を与えるなどの欠点があります。

これを踏まえ、浙江大学医学部口腔科付属病院の謝志堅教授と石傅博士のチーム、および浙江大学機械工学部の何勇教授のチームは、骨再生イベントのシーケンスを分析し、汎用的なJanus異種マイクロスフィア制御放出システムの開発と設計に協力しました。異種マイクロスフィアの放出挙動を正確に制御することで、骨治癒プロセスにおける複数の生物学的イベントをターゲットにし、骨再生のフルサイクルの効率的な促進を実現しました。関連研究「Janusマイクロスフィア送達システムは、放出プロファイルを微調整することで免疫調節と骨誘導を調整します」は、浙江大学口腔科付属病院の博士課程学生の石楊氏と修士課程学生の顧静毅氏が共同筆頭著者として、Small誌の表紙記事として発表されました（DOI：10.1002/smll.202403835）。

研究者らは、炎症期、修復期、石灰化期など、骨の治癒における複数の生物学的イベントを詳細に分析し、高度に調整可能な特性を持つメタクリロイルゼラチンを使用して、一般的に使用されている臨床生物活性分子である骨形成タンパク質-2 (BMP-2) とリン酸カルシウム物質 (CPO) の正確な制御放出を実現し、最も単純な「フォーミュラ」を使用して複雑な生物学的プロセスのオンデマンド制御を実現しました。このボトムアップの再生制御戦略 (骨再生における一連の生物学的イベントをターゲットにして骨代替物を設計する) は、臨床骨代替物の革新に新しいアイデアを提供します。

ボトムアップ再生コンセプトに基づくJanus異種マイクロスフィア制御放出システム
1. Janus 異種マイクロスフェア制御放出システムの設計と製造<br /> 研究者らは、Janus 異種マイクロスフィア制御放出システムの主成分として、高度に調整可能な特性を持つ GelMA ハイドロゲルを選択しました。GelMA の置換率を調整することで、2 つの生物活性成分 (BMP-2 と CPO) の正確な制御放出を実現しました。有効成分の置換率が異なる GelMA ベースのインクはすべて理想的なレオロジー特性 (図 1 A、B) を備えており、高精度投影光硬化 3D 印刷製造の前提条件となります。ソフトウェアでヤヌス形状の不均質マイクロスフィアを設計した後 (図 1 C)、EFL の光硬化プリンター (EFL-BP86 シリーズバイオ 3D プリンター) を使用して、粒子サイズが約 1 mm のヤヌス不均質マイクロスフィアの構築に成功しました (図 1 DF)。マイクロスフィアは理想的な注入特性を備えており (図 1 G、H)、複雑な形態の骨欠損部をしっかりと埋めるのに役立ちます。

図1 Janus異種マイクロスフェアの設計と製造
2. Janus異種微粒子の物理的・化学的特性の探究
Janus 異種マイクロスフィアの表面は無傷で、マイクロナノ多孔質微細構造を示しています (図 2 A)。CPO を含むマイクロスフィア上でカルシウム元素の分布が検出されます (図 2 B)。これは、投影光硬化 3D 印刷技術によってマイクロスフィア二相コンポーネントの精密製造が実現できることを示しています。さらに、フーリエ変換赤外線の結果から、CPO と GelMA の間に化学結合力があることが示され (図 2 C)、これが CPO の正確な制御放出の前提条件となりました。異なる置換率の GelMA ハイドロゲルにそれぞれ BMP-2 と CPO を充填し、2 つの有効成分の柔軟な制御放出を実現しました。低置換 GelMA は因子を迅速に放出することができ、高置換 GelMA は制御放出性能を示しました (図 2 D、E)。同時に、その制御放出挙動は、システム全体の分解および膨潤特性によってもある程度制御されました (図 2 F、G)。

図2 Janus異種微粒子の物理的・化学的特性の調査
3. Janus 異種マイクロスフェアが正確な免疫調節を実現<br /> 各グループの Janus 異種マイクロスフェアをマクロファージ RAW264.7 と共培養した後、高濃度カルシウムイオンの早期放出 (Fast グループ) によりマクロファージは M1 表現型に分極しましたが、低濃度 CPO の緩やかな放出 (Delayed グループおよび Sequence グループ) により M2 マクロファージの分化が促進され (図 3 AF)、炎症誘発因子 TNF-a が阻害され、抗炎症因子 IL-10 の分泌が促進されました (図 3 G)。 RNA-seqの結果はさらに、この免疫調節プロセスが骨の免疫微小環境を最適化し、JAK-STATシグナル伝達経路を活性化することで血管新生と石灰化のプロセスを加速する可能性があることを示唆しました（図3HL）。

図3 Janus異種微粒子の免疫調節能
4. Janus異種マイクロスフェアは骨再生における一連のイベントを標的とし、制御する
Janus 異種マイクロスフィアと骨髄間葉系幹細胞 (BMSC) を共培養した後、各グループの細胞増殖と活性は良好でした (図 4 A、B)。二重因子を負荷した Janus 異種マイクロスフィアの骨形成活性は、因子負荷なしの純粋な GelMA グループ (コントロールグループ) の活性よりも有意に高かったです。特に、Fast グループと Sequence グループは最高の骨形成能を示しました (図 4 CI)。これは、初期段階での BMP-2 の比較的高濃度の放出に関連している可能性があります。同時に、CPO の継続的かつゆっくりとした放出は、後期の石灰化プロセスに十分なカルシウムとリンの原料も提供しました。さらに、RNA-seqの結果は、シーケンスグループが治癒プロセス中に初期、中期、後期の骨形成関連遺伝子をアップレギュレーションし（図4J）、骨再生シーケンスイベントで複数の生物学的行動とシグナル伝達経路を活性化し（図4K、L）、骨修復プロセスの完全なサイクル制御を達成できることを示唆しました。

図4 Janus異種マイクロスフィアの骨形成特性
5. Janus 異種マイクロスフェアは、生体内の骨免疫微小環境を最適化することで効率的な骨再生を実現します。<br /> Janus 異種マイクロスフィアの生体内免疫調節および骨再生促進作用をさらに評価するため、研究者らはまず各マイクロスフィア群をラットの皮下組織に移植した。術後 3 日目と 7 日目に、マクロファージの免疫蛍光染色を実施した。その結果、すべての群が程度の差はあれマクロファージ (F4/80+) に包み込まれていることがわかった。in vitro の結果と一致して、CPO を早期に低濃度で放出する Delayed 群と Sequence 群では F4/80+CD206+ 細胞の割合が高く、Fast 群ではマイクロスフィアの周囲に多数の F4/80+CD86+ 細胞が出現した。これは、Janus 異種マイクロスフィアの異なる制御放出挙動が生体内で免疫微小環境を正確に調節できること、および低濃度カルシウムイオンの持続放出が骨形成を促す抗炎症微小環境の形成に役立つことを意味している (図 5)。各グループのマイクロスフィアをラットの頭蓋骨欠損部に移植した後、シーケンスグループは最も効率的な骨治癒を達成しました。手術から8週間後、マイクロスフィア間に大量の新しい骨が観察されました。これは他のグループのものよりも成熟しており、骨橋接続が完全になっていました。この現象は、マイクロスフィア制御放出システムにおけるBMP-2の効率的なオンデマンド放出と、初期の免疫調節に有益であり、骨マトリックスの後期の石灰化と成熟に好ましい条件を提供するCPOの持続放出によるものです。

図 5 Janus 異種マイクロスフィアの生体内免疫調節能力図 6 Janus 異種マイクロスフィアの生体内骨形成能力の画像評価図 7 Janus 異種マイクロスフィアの生体内骨形成能力の組織学的評価要約すると、この研究はボトムアップ骨修復コンセプトに基づいています。高度に調整可能な性能を持つ GelMA ハイドロゲルを採用することで、2 つの有効成分の柔軟な制御放出を実現し、骨再生シーケンス段階をターゲットにして、効率的な骨修復を完了します。この戦略は、GelMA ハイドロゲルの固有の物理的および化学的特性を最大限に活用し、化学成分を追加することなく、複雑な生物学的プロセスを正確に制御します。これは、普遍的なグリーン薬物送達および制御放出プラットフォームの構築に新しいアイデアを提供し、臨床変革のための優れた前提条件も提供します。

ソース：
https://doi.org/10.1002/smll.202403835

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