3Dバイオプリント心臓パッチがANGPT1/Tie2経路を活性化

寄稿者: ハン・カンヘ・ジャンカン寄稿部署: 西安交通大学機械製造システム工学国家重点研究室

3D バイオプリンティングに基づく新しい組織工学戦略が、動物モデルにおける急性心筋梗塞の治療に効果的なアプローチとして登場しました。しかし、移植片の生存率が低いため、3D バイオプリント組織の応用は依然として限られています。したがって、カプセル化された細胞の 3D 環境を正確に制御することで移植生存率を向上させることが、現在の研究の焦点となっています。現在、韓国の高麗大学のDo-Sun Lim教授のチームは、ヒト心筋細胞、ヒト心臓線維芽細胞、ゼラチンメタクリロイルコラーゲンハイドロゲル、バイオ3Dプリント技術などの材料を使用して、多孔質メッシュ構造を持つ新しいタイプの移植可能な3D心筋パッチ（cMesh）を準備しています。心筋細胞と心臓線維芽細胞はパッチ内によく分布しており、心筋細胞はギャップ結合チャネルを介して相互接続されており、心筋細胞の成熟とコミュニケーションを促進していました。さらに、多孔質 cMesh パッチは、細胞生存に関連する mTOR、AKT、および ERK シグナル伝達のリン酸化を増加させることによって、その構造上の利点を実証しました。急性心筋梗塞のラットに cMesh パッチを移植すると、長期の移植片生存率、血管新生および安定性が改善され、線維症が減少し、左心室肥厚が増加し、心臓機能が強化されました。実験結果により、多孔質 cMesh が急性心筋梗塞の動物モデルにおいて構造上の利点と肯定的な治療効果をもたらすことが実証されました。

バイオ 3D 印刷技術を使用して作成された cMesh パッチは、手動で重合された cPatch パッチと比較して、独自の構造上の利点があります (図 1A)。 cPatch および cMesh パッチの内側および外側領域における細胞死の数を統計的に分析しました (図 1B)。cPatch グループの内部細胞死率は 15%±2.44%、外部細胞死率は 10%±0.99% でした。対照的に、cMesh の死細胞の割合は、内側領域では 3.5% ± 0.82%、外側領域では 4.1% ± 1.61% のままでした。生細胞/死細胞生存率アッセイの結果に基づいて、cMesh群とcPatch群における細胞生存に関連するmTOR、ERK、およびAKTタンパク質の発現レベルを確認するためにウエスタンブロット分析をさらに実施した（図1C）。結果は、cMesh グループでのリン酸化 mTOR、AKT、および ERK シグナルの発現が cPatch グループと比較して大幅に増加したことを示しており、多孔質 cMesh パッチが移植片内の細胞の生存を大幅に促進できることを示しました。透過型電子顕微鏡を使用して、細胞間相互作用をより詳細に観察しました（図1D）。 0 日目には、細胞は互いに通信できません。 2 日目には、細胞が他の細胞と接触しているものの結合していない、細胞の拡散プロセスが観察されました。 4日目には細胞間膜でつながった細胞が観察されました。さらに、細胞膜と相互作用する Cx-43 および ZO-1 タンパク質の共発現により、cMesh 内に構造的に成熟したヒト心筋細胞が存在することが確認されました (図 1E)。

図 1 多孔質 cMesh パッチには独自の構造上の利点があります。 (A) 多細胞バイオインクを含む cPatch および cMesh 製造の概略図。 (B) cPatch と cMesh の内側領域と外側領域の概略図。外側領域と内側領域の細胞にラベルを付けて、生細胞 (緑) と死細胞 (赤) の分布を判定しました。 (C) cMesh および cPatch における mTOR、AKT、および ERK のリン酸化を示すウェスタンブロット分析の代表的な定量データ。 (D) 透過型電子顕微鏡は、cMesh 内の細胞の超微細構造を示しています。 (E) 細胞間相互作用のマーカーであるZO-1（緑）とCx-43（赤）の代表的な染色画像。
急性心筋梗塞の多孔性 cMesh パッチ修復におけるサイトカイン効果を調査するため、パッチ移植後 28 日目に、心臓リモデリング (MCP-1、ErbB2、MMP-9、MMP-2、TIMP-2、TIMP-1) および血管新生 (PDGF-BB、SDF-1、ANGPT-1、ANG、bFGF、EGF) に関連する一連のサイトカインを測定しました。 ANGPT1は、28日目にsham群およびcPatch群と比較してcMesh群で高く検出された（図2A）。一方、定量的データでは、cMesh群ではsham群およびcPatch群と比較してANGPT1が有意に増強されていることが示された（図2B）。しかし、cPatch 群と sham 群の ANGPT1 レベルには有意差がなかったため、7 日目と 28 日目に血清を使用して ELISA アッセイを実施し、cMesh 群と cPatch 群における ANGPT1 の発現を推定しました。 cMesh グループの ANGPT1 レベルは、7 日目に cPatch グループの ANGPT1 レベルと定量的に同様でした。対照的に、cPatchのANGPT1レベルは28日目にcMesh群と比較して有意に減少した（図2C-D）。 cMesh 群と cPatch 群における ANGPT-1 受容体 Tie-2 の発現を定量的に比較するために、qPCR とウェスタンブロット分析によって遺伝子発現とタンパク質レベルを確認しました (図 2E–G)。 cMesh 群の Tie-2 遺伝子の発現レベルは cPatch 群よりも高かった。 28日目には、cMesh グループのタンパク質発現レベルも cPatch グループと比較して大幅に向上しました。 ANGPT/Tie2と血管新生の関連に関するこれまでの研究結果に基づいて、梗塞周囲領域における血管新生を評価するために免疫蛍光アッセイを実施した（図2H）。 cMesh および cPatch の移植後 28 日目には、cMesh および cPatch グループでは、sham グループと比較して血管新生がより顕著でした。さらに、cMesh群ではcPatch群と比較してSMA陽性血管の総数が増加した（図2I）。さらに、SMA陽性血管の総数は小血管、中血管、大血管に細分化され、cMesh群の大血管の割合はcPatch群およびsham群よりも高かった（図2J）。

図2 cMeshパッチを移植した急性心筋梗塞ラットの心臓構造の維持と血管新生は、ANGPT1/Tie2経路の活性化によって改善されました。 (AB) 代表的な心臓リモデリングおよび血管新生サイトカインアレイパネルと、sham、cPatch、cMesh グループからの溶解物の定量分析。 (CD) 7日目と28日目のcPatch群とcMesh群におけるANGPT1レベルのELISAアッセイ。 (E) 定量PCRを使用して、cMesh群とcPatch群のラットのTie2 mRNAの発現レベルを検出しました。 (FG) cMesh 群および cPatch 群のラットにおける Tie2 のウェスタンブロット画像と定量データ。 (H) Sham群およびcPatch cMesh群における成熟血管の免疫蛍光画像。 (IJ) SMA陽性血管の定量分析とSMA陽性血管の割合。
この研究の結果は、バイオ3Dプリンティングによって作製された多孔質心筋パッチが適切な微小環境と機械的特性を備え、細胞の生存率を向上させ、体内に多数の細胞を長期間保持することができ、組織再生の効率を向上させる可能性があることを示している。
参考文献:

Kim KS、Joo HJ、Choi SC、他3Dバイオプリント心臓メッシュ移植は、ANGPT1/Tie2経路を介して急性心筋梗塞ラットの心臓機能と血管新生を改善する[J]。Biomanufacturing、2021、13(4): 045014。https://doi.org/10.1088/1758-5090/acle78。

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