創傷治癒を改善する多層皮膚の3Dバイオプリント

出典: Spectrum および Liquid Core Medical Devices 医療エンジニアリングクロスオーバーチーム

全層皮膚欠損の修復は臨床診療における大きな課題です。生きた細胞と生体材料のバイオプリンティングは、この課題に対処するための有望な技術です。しかし、生体材料の供給源が限られていること、材料の準備に時間がかかること、そしてその成形プロセスが、対処しなければならないボトルネックとなっています。これを基に、人民解放軍総合病院のミンリアン・チェン氏のチームは、「微細断片化脂肪細胞外マトリックスと細胞からなる 3D バイオプリント生体模倣多層インプラントが、マウスの全層皮膚欠損モデルの創傷治癒を改善する」と題する論文を ACS Applied Materials & Interfaces 誌に発表しました。この研究では、斬新で迅速かつ簡単な方法が開発されました。この方法では、脂肪組織を直接処理して微小断片化脂肪 ECM (mFAECM) を取得しますが、印刷することはできません。 mFAECM を印刷可能にするために、メタクリロイルゼラチン (GelMA) とメタクリロイルヒアルロン酸 (HAMA) を混合して複合バイオインクを調製しました。同時に、本研究では、mFAECMをバイオインクの主成分として用い、真皮、表皮、血管形成に対応するさまざまなバイオインクを調製し、バイオニック多層皮膚のバイオプリンティングを完了しました。創傷治癒実験では、バイオプリントされた皮膚が優れた治癒効果を持つことが示されました。

1. mFAECMの調製と特性評価

脂肪吸引物は、3 回の凍結融解サイクルの後に均質化され、均一な乳化懸濁液が得られました。遠心分離後、製品には透明な油状の上部層、中間層に淡黄色の ECM、下部層に大きくて太い繊維が含まれます。 ECM を得た後、黄色のオイルがなくなるまでイソプロパノールで繰り返し抽出しました。均質化された ECM は均一で密度の高い綿状の外観を呈します。 DAPI 染色により、ECM 断片は 100 μm × 200 μm より小さく、したがって内径 300 μm のノズルを容易に通過できることが示されました。 mFAECMと天然組織の主成分を分析した結果、コラーゲン含有量はそれぞれ110.38±9.60μg/mgと99.2±10.54μg/mg、sGAG（グリコサミノグリカン）含有量はそれぞれ2.85±0.35μg/mgと3.11±0.40μg/mgでした。これは、天然組織のコラーゲンと sGAG のほとんどが mFAECM に保持されていることを示唆しています。コラーゲンとグリコサミノグリカンは組織の再生に重要であり、創傷治癒中の組織の恒常性、細胞移動、細胞シグナル伝達の調節を担っています。

図1. mFAECMの調製と特性
2. バイオニック多層皮膚の作製<br /> mFAECM 複合バイオインクの印刷可能性を評価するために、この研究では 3D プリントを使用して円形のメッシュ状の 4 層構造を製造しました。構造は忠実度が高く、設計されたパターンとの一貫性も高いです。高解像度カメラで撮影された画像では、バイオインクの軌跡が連続しており、各フィラメントが融合したり折り畳まれたりすることなく独立して分布していることが示されました。 SEM 画像では、細胞が孔に付着していることが示されました。結論として、mFAECM 複合バイオインクは印刷性と忠実度に優れ、細胞接着をサポートできます。
図2. バイオニック多層皮膚の製造と微細構造
3. バイオニック多層皮膚がマウスの皮膚創傷治癒を促進する

現在、脂肪由来の非ペプシン消化 ECM を皮膚のバイオプリンティングに直接使用する研究はありません。 mFAECM と細胞で構成されたバイオプリント多層皮膚が生体内創傷治癒に及ぼす影響を評価するために、ヌードマウスで全層皮膚欠損モデルを作製しました。移植後7日目には、細胞を充填したグループの創傷面積が最も小さく、ブランクグループの創傷面積が最も大きくなった。 14日目には、細胞を注入したグループの傷だけが完全に閉じました。形態学的分析により、バイオプリントされたバイオニック多層皮膚が最良の創傷治癒効果を持つことが示されました。 H&E染色では、移植後7日目に、細胞負荷群の修復効果が無細胞群およびブランク群よりも優れていることが示されました。細胞を充填したグループでは表皮構造の大部分が形成されていたが、無細胞グループの表皮構造は依然として構造体で覆われていた。ブランク群は主に血液かさぶたおよび脆弱な肉芽組織で構成されていました。 14日目には、細胞を含んだグループと細胞を含まないグループの表皮構造はより完全な状態でした。無細胞群と比較すると、細胞を充填した群の真皮構造はより均一に分布しており、血管と線維組織がはっきりと見えました。

図3. 全層皮膚欠損マウスの創傷治癒
4. バイオニックスキンは生体内での血管新生とコラーゲン合成を促進する

組織工学における最も困難な課題の 1 つは、標的組織への栄養素の送達に直接関係する血管新生です。 CD31 は、創傷治癒中の新しい毛細血管を評価するために使用される血管内皮細胞マーカーです。免疫組織化学の結果では、細胞負荷群では CD31 発現が有意に高かったことが示されました。さらに、RT-qPCR 分析により、細胞負荷群の VEGF 発現は、7 日目と 14 日目に細胞負荷群およびブランク群よりも有意に高かったことが示されました (補足資料を参照)。したがって、バイオニックスキンは血管新生を促進することで創傷治癒を促進することがわかります。
図 4. 生体模倣多層皮膚の血管新生への影響コラーゲンは、組織強度を高め、細胞の接着と移動を促進することで、創傷治癒に重要な役割を果たします。 MT 染色は、バイオニック多層皮膚が創傷コラーゲン沈着に及ぼす影響を評価するために使用されました。ブランクグループと比較すると、移植後 7 日目と 14 日目に細胞充填インプラントと無細胞インプラントで治療した創傷では、より多くのコラーゲン繊維とより整然とした配列が観察されました。 7日目には、細胞負荷群のコラーゲン面積は、脱細胞化群およびブランク群のコラーゲン面積よりも有意に大きくなっていました。 14日目には、細胞負荷群のコラーゲン面積も、細胞無負荷群およびブランク群よりも有意に増加しました。

図5. バイオニック多層インプラントのコラーゲン沈着への影響
5. まとめ この研究では、脂肪組織を直接処理して mFAECM を取得し、それをバイオインクの主成分として使用してバイオプリントされた細胞を含んだ生体模倣多層皮膚を製造する迅速かつ簡単な方法について説明します。結果は、mFAECM 複合バイオインクは印刷性と忠実度が優れており、細胞接着をサポートできることを示しました。バイオニック多層皮膚は傷の治癒を早める可能性がある。この研究は、大規模な全層皮膚欠損の治療に不可欠な、バイオプリント皮膚代替品の迅速な製造を改善するための効果的な方法を提供します。

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