投影光造形法3Dプリントされた高度に生体模倣した足場に人工ナノ小胞を充填し、大部分の骨の再生を促進する

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

外傷、感染、骨腫瘍の切除などにより生じた大きな骨欠損は再生能力が限られており、それに伴う機能喪失が患者の生活の質に重大な影響を及ぼすため、大きな骨欠損の修復に対する需要が広がっています。現在、大部分の骨の修復のためのインサイチューバイオニックスキャフォールド移植は、再生医療の分野で大きな人気を集めています。しかし、適切な早期微小環境調節能力が欠如しているため、大きな分節骨欠損を修復するための原位置骨バイオニックスキャフォールドの使用は、まだ大きな臨床的進歩を達成していません。

華中科技大学の Sun Jiaming 氏のチームは、骨の自然なマイクロチャネルと皮質ネットワークにヒントを得て、投影光立体造形 3D 印刷技術 (EFL-BP8601 Pro) を使用して、外層の皮質骨、内層の複雑な網状海綿骨、ハバース管、横方向に貫通するフォルクマン管を備えた高度にバイオニックな PCLMA 骨スキャフォールドを製造しました。次に、脂肪幹細胞由来の人工ナノ小胞 (ADSC-EN) をビオチン-ストレプトアビジンシステムを介してスキャフォールド表面に安定的に搭載しました。スキャフォールドは、骨欠損部に適した有効成分を含むバイオニック構造サポートを提供し、欠損部の局所血管新生と骨形成微小環境を人工的に構築します。実験結果によると、このスキャフォールドは生体適合性が良好で、血管新生と骨形成を大幅に促進できることが示されています。関連研究は、2024年4月8日に国際的に有名なジャーナル「Biomaterials」に「3DプリントされたバイオニックスキャフォールドとエンジニアリングされたADSCナノベシクルによる相乗的な大分節骨修復：最適化された再生微小環境に向けて」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容

【人工ナノ小胞の特性評価とビオチン化】

著者チームは、人工ナノ小胞（EN）を高収率で得るために、それぞれ10μm、5μm、1μmの孔径を持つ膜を使用してADSCを連続的に押し出す機械的押し出し法を採用しました。走査型電子顕微鏡（SEM）では、ENの形態は楕円形であることが示されました（図1A）。さらに、ナノ粒子追跡分析（NTA）により、ENのサイズは50～150 nmで最大ピークは62 ± 1.5 nmであり、粒子数は全粒子の86.35%（n = 3）を占めることが実証されました（図1B）。タンパク質の定量化により、1×107ADSCから得られたENのタンパク質濃度は88.35±6.62μg/mLに達する可能性があるのに対し、同じ数のADSCから得られた細胞外小胞（EV）のタンパク質濃度はわずか2.85±1.04μg/mL（n=3）であることが示されました（図1C）。 EV、EN、および細胞のクマシーブリリアントブルー分析では、ENと細胞のタンパク質濃度はSDS-PAGEプロファイルが非常に類似していたのに対し、EVのSDS-PAGEプロファイルは完全に異なっていたことが示された（図1E）。第二に、ビオチン官能化1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミンポリ（エチレングリコール）（DSPE-PEG）（DSPE-PEG-ビオチン）をENの機械的押し出し改質に使用しました。 EN の修飾結果は FITC 標識ストレプトアビジンを使用して評価され、蛍光顕微鏡画像ではビオチンが EN 上に正常に修飾されていることが示されました (図 1D)。

図1 人工ナノ小胞の特性評価とビオチン化 [PCLMAの特性評価と材料の表面ビオチン化]

まず、3 アームポリカプロラクトン (PCL) を MAAh を使用して PCLMA に改質し、PCL 材料の光硬化特性を満たしました (図 2A)。 PCLMA樹脂による光架橋後の光学画像は、MAAh修飾3アームPCLが光硬化能を持ち、405 nmの紫外線を20秒間照射した後、安定した硬化を達成したことを示しました（図2B）。その後、投影光硬化型 3D 印刷技術を使用して PCLMA の印刷性能を研究し、印刷精度テスト用にさまざまな構造を設計しました。さらに、印刷された細部を調査するために、マクロレンズを使用して多角度の撮影を行いました。結果は、PCLMA がさまざまな 3 次元構造を高い印刷精度で印刷できることを示しており、赤い矢印は PCLMA が最大 100 μm まで印刷できることを示しています (図 2C)。 PCLMA の合成中に過剰な MAAH がほぼすべての末端ヒドロキシル基を置換したため、生体模倣スキャフォールドの表面を最初に塩酸と過マンガン酸カリウムで処理して表面ヒドロキシル基を露出させ、次にビオチンでさらに修飾してスキャフォールド表面のビオチン修飾を実現しました。次に、ENSの負荷を向上させるために、生体模倣スキャフォールドの表面でビオチンを修飾しました（図2D）。バイオニック骨スキャフォールドは、PCLMA 材料を使用した印刷の実現可能性を調査するために、中央髄管、末梢ハバース管、外側フォルクマン管を備えて設計されました (図 2E)。その後、生体模倣骨スキャフォールドは、ストレプトアビジンの移植のためにビオチンで修飾されました。最後に、スキャフォールドの詳細をさまざまな角度から観察したところ、PCLMA スキャフォールドとバイオミメティックスキャフォールドはどちらも良好なバイオミメティック構造を示しました (図 2F)。 FT-IR分析の結果、HCl/KMnO4処理後に得られたPCLMA-OHはPCLMAと比較して3300～3650 cm-1にピークを示し、表面ヒドロキシル基が露出していることが示されました。さらに、ビオチン化 PCLMA (PCLMA-Bio) は 1500～1580 cm-1 に小さなピークを示しましたが、これは PCLMA-OH と比較してわずかにシフトしており、EDC/DMAP 化学カップリングによってビオチンがスキャフォールド表面にうまくグラフトされたことが確認されました。次に、ストレプトアビジンを FITC で標識し、蛍光顕微鏡検査により、PCLMA-Bio Avidin+ は PCLMA よりも強い蛍光シグナルを示し、PCLMA のビオチン化が成功したことも示されました (図 2G)。

図2 PCLMAの特性と材料の表面ビオチン化[材料表面へのENの安定したグラフト化]

体外でのスキャフォールドのグラフト安定性を検証するために、ビオチン化ADSC-ENをビオチン化PCLMA、PCLMA-OH、および純粋なPCLMAとストレプトアビジンの存在下で共培養し、超音波洗浄機を使用して超音波処理して機械的安定性をテストしました（図3A）。蛍光画像では、超音波処理時間が長くなるにつれて、ADSC-EN の保持率が徐々に低下することが示されました。 60秒間の超音波処理後、赤色蛍光標識されたADSC-ENはビオチン化PCLMA上で明確に検出されたが、対照的にPCLMA-OHまたはPCLMA上にはほとんど蛍光領域は見られなかった（図3B）。具体的には、60秒におけるPCLMA-BAS-EN、PCLMA-OH、PCLMAの蛍光面積（ピクセル）はそれぞれ1784.80±259.24、10.00±3.74、9.80±3.81であった（図3C）。複雑構造のスキャフォールドにおける小胞の負荷を改善するために、私たちは、灌流チャンバー、2 つのデジタル制御蠕動ポンプ、および 2 つの培地容器で構成される、バイオミメティックスキャフォールドに EN を移植するためのさまざまな灌流方向を持つ灌流システムを設計しました。設計された灌流チャンバーは、灌流部分と上部の 2 つの部分で構成されています (図 3D)。前者は白色感光性樹脂で作られており、灌流ステントを収容するために使用され、後者はリアルタイム観察用に半透明樹脂で作られています。灌流セクションの中央に最大 2 本のサポートロッドを配置して、複数のバイオニックスキャフォールドを固定できます。さらに、チャンバー内には印刷前に上部と注入部分をそれぞれ固定するための固定ピンが 4 本あります。注目すべきは、灌流部分には培地灌流システムとの接続を確立するための開口部が含まれており、この開口部は肉眼的には互いに直交する 2 つの方向に分割されており、すべての開口部の直径は 2 mm であることです。複雑構造のスキャフォールドに充填された EN の安定性を調べるために、超音波洗浄機が使用されました。走査型電子顕微鏡画像では、30秒間の超音波処理後、灌流グラフト群の表面のENの数が非灌流グラフト群の数よりも有意に多かったのに対し、非グラフト群の表面にはENがほとんど残っていなかったことが確認されました（図3E）。著者らは、灌流装置によりステント表面のENのグラフト効率が大幅に向上したと推測しています。灌流移植群のスキャフォールドのさまざまな部分の走査型電子顕微鏡画像では、ENがスキャフォールドの骨髄腔内の複雑な構造の表面でさえも、スキャフォールド表面のすべての部分で均一かつ効率的な負荷を達成していることが示されました（図3F）。

図3 材料表面へのENの安定した移植[ウサギの骨欠損を修復するためのPCLMA-BAS-ENスキャフォールドに関する実験的研究]

この戦略の臨床応用の可能性をさらに検証するために、著者らはウサギの橈骨の原位置骨形成アッセイを使用して 2 つのスキャフォールドの骨形成能力を分析し (図 4A-B)、EN を搭載した PCLMA スキャフォールド (PCLMA-BAS-EN グループ) とビオチン-ストレプトアビジン法で搭載された純粋な PCLMA スキャフォールド (PCLMA グループ) を使用して、ウサギの橈骨の大きな骨欠損 (長さ 15 mm) を修復しました。 1、2、3か月後の生体CT画像では、3つのウサギグループの骨欠損修復状態に有意な差が見られました。PCLMA-BAS-ENsグループの骨欠損のほとんどは3か月で修復され、欠損領域の両側の骨癒合はより完全かつ連続的になり、運動機能と活動機能は正常に戻りました。 1、2、3 か月後の生体 CT 画像では、3 つのウサギグループ間で骨欠損の修復に有意な差が見られました。 3 か月目までに、PCLMA-BAS-ENs グループの骨欠損の大部分が修復され、欠損部位の両側の骨癒合は比較的完全になり、運動機能と活動機能は正常に戻りました。 PCLMA グループでは骨組織のごく一部のみが修復されましたが、それでも骨再生が明らかに不十分でした。予想通り、未治療の対照群では修復の兆候はほとんど見られませんでした（図4C）。注目すべきは、定量分析により、PCLMA-BAS-ENs 群のほとんどの定量指標が PCLMA 群およびブランク対照群よりも高いことが判明し、ENs 搭載バイオニックスキャフォールドによって作成された誘導骨微小環境が骨再生に重要な役割を果たしていることを示していることです (図 4D)。上記の検査結果と一致して、12週目の組織学的染色では、PCLMA-BAS-ENsグループの骨欠損領域全体の骨形成が比較的完了しており、目に見える未熟なコラーゲン繊維（青色の領域）の領域が広範囲に見られました。 PCLMA グループでは、欠損部の中心部において、顕著な骨再生と線維組織形成、および不連続な骨の統合が観察されました。未治療のブランク群では、欠損部の中央領域に明らかな組織損失領域が認められた（図5A-B）。特に術後12週では、PCLMA-BAS-ENの内皮細胞は十分に発達し、連続していました。さらに重要なことは、これらの結果により、小胞を充填した生体模倣骨足場システムが宿主の血管の成長を促進し、橈骨の再生を加速することが確認されたことです。さらに、骨再生中の骨形成に関連する発現の可能性を調べるために、移植後12週目に免疫組織化学染色（BMP-2、Runx2、OCN）を実施しました（図5C～E）。定量分析の結果、BMP-2、Runx2、OCNの骨関連発現レベルがPCLMA-BAS-ENs群で増加していることが示された（図5F）。結論として、これらの結果は、EN を搭載した生体模倣骨スキャフォールドが、生体内で局所的な骨形成微小環境を調節し、骨の再生と修復を促進できることを示唆しています。

図4 ウサギの骨欠損を修復するためのPCLMA-BAS-ENsスキャフォールドに関する実験的研究図5 12週目の再生組織の代表的な染色画像[バイオニック骨誘導スキャフォールドは局所骨形成微小環境を調節する]

研究によると、組織欠損部位の局所微小環境を調節する重要な期間は、外傷発生後 3 日以内であることがわかっています。著者らは、ウサギの骨欠損部位に移植されたスキャフォールドを3日目に収集し、その中には小胞を充填したスキャフォールド3つ（PCLMA-BAS-ENsグループ）と純粋材料を充填したスキャフォールド3つ（PCLMAグループ）が含まれており、スキャフォールド表面のタンパク質を溶出してプロテオーム解析を行った。この研究では、定量的プロテオミクスとDIAの有意基準（FC > 1.2、P < 0.05）に基づいて、857個のアップレギュレーションタンパク質と37個のダウンレギュレーションタンパク質が特定され、データはボルケーノプロット（図7A）とヒストグラム（図7B）の形式で提示されました。 KEGG パスウェイ解析により、発現が異なるタンパク質が明らかになりました。具体的には、上位 20 のタンパク質は、酸化リン酸化、cAMP シグナル伝達経路、cGMP-PKG シグナル伝達経路、白血球経内皮遊走、ケモカインシグナル伝達経路などの複数の生物学的プロセスに濃縮されていました (図 7C)。同時に、GO濃縮解析により、差次的に発現したタンパク質がインターフェロン-γに対する細胞応答、酸化還元プロセス、正の走化性、上皮成長因子に対する応答、好中球走化性の正の調節などに関与していることが示された（図7D-F）。バイオニックスキャフォールドの骨形成促進における細胞メカニズムをさらに解明するために、PCLMA-BAS-ENs グループと PCLMA グループ (n = 6) に対して、それぞれ 3 日目と 7 日目に免疫蛍光染色を実施しました。定量結果では、7 日目に、PCLMA-BAS-ENs グループの M1 マクロファージ関連マーカー CD86 の発現レベルは PCLMA グループよりも低く、PCLMA グループの M2 マクロファージ関連マーカー CD163 の発現レベルは PCLMA グループよりも低いことが示されました。さらに、7日目には、PCLMA-BAS-ENs群のrBMSC関連マーカーCD44およびCD29の発現レベルもPCLMA群よりも有意に高く、BMSCの凝集が明確に観察されました（図6AおよびB）。

図6 バイオニック骨誘導スキャフォールドの免疫調節と幹細胞リクルートメント図7 バイオニック骨誘導スキャフォールドが局所骨形成微小環境に及ぼす影響の調節メカニズム
2. まとめと展望<br /> 本研究では、投影光立体造形法3Dプリンティング技術を用いて高精度のバイオニック骨スキャフォールドを作製することに成功し、灌流装置を介してビオチン標識ENをその上に移植しました。この慎重に設計された生体模倣足場には、骨形成を促す微小環境を確立するために、人工ナノ小胞が豊富に搭載されています。生体内実験では、大きな骨欠損の修復を促進する能力がさらに確認されており、これは早期の免疫調節、血管新生、および骨形成反応に起因すると考えられます。したがって、この研究は、機能化された高精度の生体模倣スキャフォールドの研究に有望な戦略を提供し、骨欠損微小環境の局所制御への道を開きます。

ソース：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122566

投影光造形法3Dプリントされた高度に生体模倣した足場に人工ナノ小胞を充填し、大部分の骨の再生を促進する

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