バイオプリンティングの画期的な出来事！数億個の細胞の密度で 50um の解像度を実現！

出典: EFL Bio3Dプリンティングとバイオ製造

3 次元 (3D) 人工組織は、生体材料の足場と生きた細胞で構成された人工の機能組織です。人工組織は、基礎生物医学研究、疾患モデル化、薬物試験、個別化医療、再生医療、臓器移植など、多くの生物医学的用途に使用されています。従来の 2D 単層細胞モデルや動物モデルと比較して、3D 人工組織は、天然組織の 3D 構造、細胞タイプ、物理的および生化学的環境を正確に再現することが期待されており、in vitro 組織または臓器モデルの生物学的関連性、拡張性、再現性が向上します。さらに、自己細胞で開発された 3D エンジニアリングの移植可能な組織や臓器は、臓器提供者の不足や免疫拒絶に関連する問題を軽減する可能性があります。そのため、組織工学は多くの研究上の関心を集めています。しかし、高い細胞密度、高い細胞生存率、高解像度の要件を同時に満たすことは非常に困難です。特に、デジタル光処理ベースの 3D バイオプリンティングのバイオプリンティング解像度は、光散乱によりバイオインクの細胞密度が増加するにつれて低下します。

この問題に対処するため、カリフォルニア大学サンディエゴ校の Shaochen Chen 氏のチームは、散乱によって引き起こされるバイオプリンティング解像度の低下を軽減する新しい方法を開発しました。結果は、バイオインクにヨウ素グリコールを添加すると、光の散乱が 10 倍減少し、HCD を使用したバイオインクの製造解像度が大幅に向上することを示しました。この研究では、1 ミリリットルあたり 1 億個の細胞密度を持つバイオインクを使用して、50 ミクロンの解像度の製造に成功しました。組織/臓器の 3D バイオプリンティングへの潜在的な応用を実証するために、この研究では、微細な血管ネットワークを備えた HCD 厚組織を作製しました。組織は灌流培養システムで生存し、培養14日後には内皮化と血管新生が観察されました。関連研究は、2023年2月22日にトップクラスの国際学術誌「Science Advances」に「血管組織を製造するための高細胞密度および高解像度3Dバイオプリンティング」と題する論文として掲載されました。

1. 革新的な研究内容<br /> 押し出しベースの 3D 印刷では 50 μm の公称解像度を達成でき、光ベースの印刷ではマイクロメートル範囲の公称解像度を達成できますが、このような微細な特徴は通常、特定の最適化された製造条件の下で、カプセル化された細胞なしで生体適合性の低い材料を使用した場合にのみ実現可能です。実際のバイオプリンティングアプリケーションでは、細胞をカプセル化したバイオインクを使用した製造解像度は、公称ケースと比較して大幅に低下することがよくあります。押し出しベースの 3D バイオプリンティングでは、細胞密度を高めたり、バイオインクで球状体を使用したりするには、より大きなノズルを使用する必要があります。そうしないと、押し出しプロセス中に発生するせん断応力により、細胞の生存率が大幅に低下します。通常、1000 万細胞/ml 以上の密度の場合は、200 μm 以上のノズルを使用し、印刷解像度を 200 ～ 500 μm にする必要があります。光ベースの方法の場合、細胞によって引き起こされる光散乱効果により、典型的な細胞カプセル化バイオプリンティングの解像度は数十から数百マイクロメートルになります。一部の化学添加物は光の散乱によって引き起こされる望ましくない凝集を軽減できますが、これらの化学物質は細胞毒性を持つことがよくあります。 DLP および大容量 3D バイオプリンティングでは、散乱の影響を軽減し、細胞を含んだバイオインクの製造解像度を向上させる計算方法を提案する研究者もいます。しかし、これらの研究は低細胞密度（≤1000万細胞/ ml）に限定されていました。したがって、HCD（2000万細胞/ ml以上）、高い細胞生存率（80%以上）、および高い製造解像度（50μm以下）を同時に備えた3Dバイオプリント構造を製造することは困難です。この研究では、これを 3D バイオプリンティングにおける密度、生存率、解像度の三難問題と呼んでいます (図 1)。

図 1 HCD バイオインクでの高い製造解像度の実現研究により、細胞と周囲の生体材料間の屈折率の不一致によって引き起こされる散乱は、屈折率の調整によって最小限に抑えられることが示されています (図 1)。バイオインクの光学特性の測定と光伝播のシミュレーションにより、IDX がバイオインクの屈折率を効果的に調整し、カプセル化された細胞による光散乱を大幅に削減できることが確認されました (約 10 分の 1)。ここでは、製造解像度 50 μm の HCD (1 億細胞/ml) を使用した 3D バイオプリンティングについて説明します。免疫蛍光画像と RNA シーケンシング (RNA-seq) によっても、このアプローチを使用して健康で機能的な 3D 人工組織を製造できることが検証されました。 IDX をバイオインクに添加した場合、細胞の生存率、増殖、または表現型に統計的に有意な変化は観察されませんでした。この研究では、全体の大きさが17 mm × 11 mm × 3.6 mm、血管の直径が250～600 μm、細胞密度が4000万個/mlの厚い血管形成前組織を作製できることも実証されました。 14 日間の灌流培養後、これらの組織で内皮化と血管新生が観察されました。

図 2 光学特性と光エネルギー分布この研究では、5% GelMA とさまざまな濃度の IDX を含むバイオインクの屈折率をバイオプリンターの動作波長 (405 nm) で測定することにより、IDX が屈折率を効果的に調整できることを検証しました。図 2 に示すように、IDX 濃度が 20% から 35% に増加すると、バイオインクの屈折率は直線的に増加しました。この研究ではさらに、適切な濃度の IDX がバイオインクの散乱効果を効果的に低減できることが検証されました。材料の散乱効果は通常、散乱係数、異方性、および低減散乱係数によって特徴付けられます。この研究では、5% GelMA、4000万細胞/ml、さまざまなIDX濃度を含むバイオインクを準備し、モンテカルロシミュレーションと粒子群最適化アルゴリズムを組み合わせた方法を使用して、バイオプリンターの動作波長（405 nm）でのバイオインクの散乱特性を決定しました。これらのバイオインクの測定された散乱係数、異方性、および低減された散乱係数を図 2 (B ～ D) に示します。高い散乱係数と 1 に近い異方性値は、細胞を含んだバイオインクが主に前方方向に高い光散乱性を示すことを示しています。屈折率を調整していないバイオインクの散乱係数は11.76 mm-1であったが、屈折率を調整することで散乱係数は0.164 mm-1に減少した。 30% IDXを使用して屈折率を調整することで、バイオインクの散乱係数は1.377 mm-1に大幅に減少し、減少した散乱係数は0.014 mm-1に減少しました。これは、この方法により散乱を約10倍削減できることを意味します。 IDX の濃度を慎重に調整することで、散乱をさらに低減できます。

図 3 生体適合性分析 IDX とさまざまな生体材料および細胞タイプとの生体適合性を検証するために、この研究では、GelMA 内のヒト臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)、グリシジルメタクリレートヒアルロン酸 (GMHA) 内のヒトシュワン細胞 (HSC)、およびアルギン酸メタクリレート (AlgMA) 内の C2C12 という 3 つの一般的な配合を使用してシートをバイオプリントしました。理想的な IDX 濃度範囲は 20% から 35% の間で変化するため、この研究では 0% または 35% の IDX を使用して 3D プリントされた組織を比較しました。 Cell Counting Kit-8 (CCK-8) アッセイを使用して測定された代謝活動強度は、3 種類のバイオインクすべてに封入された細胞が 7 日間の培養プロセス中に指数関数的に増殖したことを示しました。さらに、IDXの使用は対照と比較して細胞の代謝活動に統計的に有意な影響を与えず、IDXが細胞増殖を妨げないことを示唆した（図3）。さらに、この研究では細胞の生存率を特徴付けるために生死染色が使用されました。 GelMA バイオインクの HUVEC は、IDX が 0 または 35% のシートとして印刷されました。全体的に、培養 1 日目と 7 日目に、0% および 35% IDX サンプルの両方でほとんどの細胞が生存可能でした。 0% と 35% IDX の間には有意な質量差は見られず、IDX の取り込みが細胞生存率に大きな影響を与えなかったことが示唆されました。

図 4 3D プリントされた血管化された灌流可能な厚い組織細胞誘起光散乱によって引き起こされる密度、生存率、解像度の三重苦のため、光ベースの方法を使用して血管化前の組織を直接 3D プリントするこれまでの研究では、通常、細胞密度がないか低いか、製造解像度が低いものに限られています。この研究では、4000万細胞/mlを含む屈折率が一致したバイオインクを使用して、厚い（17 mm x 11 mm x 3.6 mm）血管形成前組織構造を設計し、3Dプリントしました（図4）。中空の血管の直径は 250 ～ 600 μm の範囲です。 HUVEC とヒト真皮線維芽細胞 (HDF) は、それぞれ 2,300 万個/ml と 1,700 万個/ml の密度で GelMA バイオインクに封入されました。図 4 は、3D プリント構造のマイクロコンピュータ断層撮影 (μCT) 画像 (透視図と断面) と、プリント構造の明視野顕微鏡画像 (上面図と断面) を示しています。スキャフォールド内に中空のチャネルが観察され、望ましい複雑な微細構造の特徴を細胞化スキャフォールド内に高解像度かつ忠実に印刷できることが示唆されました。これにより、高密度で均一に混合された細胞が印刷された構造内に封入されていることが確認されました。

2. まとめと展望<br /> この研究では、IDX を添加した GelMA バイオインクで 1 億細胞/ml の細胞密度で 50 μm の解像度を達成しました。さらに、構造の完全性を損なうことなく、インクを使用して最大 2 億 2,500 万セル/ml のセル密度で GelMA 円筒形構造 (直径 1.5 mm、高さ 1 mm) を 3D プリントすることができました。これらの HCD 人工組織は柔らかい (ヤング率は約 1 kPa) ですが安定しており、操作中に分解しません。この柔らかい構造は、自立していると操作が困難ですが、カバーガラスに印刷すると操作が容易になります。細胞密度は生理学的に観察される密度（10億～30億細胞/ml）よりはまだ低いですが、この技術により、HCD、高い生存率、高解像度を同時に実現した3Dバイオプリンティングが可能になります。この技術は単純かつ一般化可能であり、ほとんどの生体材料や細胞タイプに簡単に適用できます。これは、HCD と精巧な血管ネットワークが不可欠な、機能的で大規模かつ臨床的に移植可能な組織や臓器を作成できるようになるための重要なステップです。

ソース：
https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ade7923

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