3D プリント技術を使用して、骨軟骨の再生を促進する細胞含有複合ハイドロゲルシステムを準備する方法

出典: EngineeringForLife

人口の高齢化とスポーツ傷害の増加により、骨軟骨（OC）欠損は深刻な世界的健康問題になりつつあります。組織工学インプラントは欠損部位に機械的なサポートを提供し、生体活性因子のキャリアとして機能して原位置細胞を動員したり、局所の有害な微小環境を再形成したりすることで、OC再生の潜在的な代替アプローチを示唆しています。

今号では、EFL は「The Innovation」誌に掲載された「3D バイオプリントされた異方性二細胞生体ハイドロゲルが軟骨と骨の界面の再構築により骨軟骨の再生を促進する」という研究を例に、メタクリロイルゼラチン (GelMA) とメタクリロイルアルギン酸 (AlgMA) で作られた複合ハイドロゲルをバイオインクとして使用し、関節軟骨形成細胞 (ACPC) と骨髄間葉系幹細胞 (BMSC) を同時に層状に埋め込み、骨軟骨の再生を促進する異方性二細胞生体ハイドロゲル (ABLH) を正確に印刷する方法を分析します。

ABLHを選ぶ理由

メタクリロイルゼラチン（GelMA）は優れた印刷能力と迅速な光架橋を有しており、バイオプリンティングの実現可能性を向上させることができます。本研究では、GelMAの優れた生体適合性とAlgMAの容易な操作性に基づいて、デュアルチャネル押し出し3Dバイオプリンティング技術により、GelMAとAlgMAで構成される異方性二細胞生体ハイドロゲル（ABLH）を製造しました。軟骨由来の ACPC と骨髄由来の BMSC は、高い細胞生存率を維持しながら ABLH の層別化に割り当てることができます。さらに、均質なハイドロゲルと比較して、ABLH は新しい軟骨と軟骨下骨のより高い同期再生率を示し、これにより軟骨 - 骨 - 血管のクロストークが制御され、より優れた軟骨 - 骨界面が実現しました。

ABLHの準備方法

（１）GelMAとAlgMAの合成とバイオインクの調製：A型豚皮ゼラチンまたはアルギン酸ナトリウムを50℃でPBSに溶解し、メタクリル酸無水物を加えて反応させた。その後、溶液を希釈し、蒸留水に対して40℃で3日間透析し、3日間凍結乾燥させた。サンプルは使用前に紫外線で 2 時間殺菌し、その後 GelMA を 37 °C で PBS に溶解し、光開始剤と AlgMA を加えて均一に撹拌し、懸濁細胞を加えてバイオインクを調製しました。 (EFL は GelMA および AlgMA ハイドロゲル製品シリーズを提供できます。詳細については、記事の最後に記載されている地域販売にお問い合わせください)

（２）ABLHのバイオプリンティング：3Dバイオプリンターを用いてバイオプリンティングを行った。室温で70kPaの圧力でバイオインクを異なる割合で押し出した。押し出し圧力は、線がスムーズに押し出されるか、最大70kPaに達するまで徐々に増加した。針のサイズは0.3mm、線間隔は0.5mmに設定した。 (EFL は押し出しベースの生物学的 3D プリンターシリーズを提供できます。詳細についてはリンクをクリックしてください)

ABLHの利点と機能

（１）ABLHは優れた物理的・機械的特性と生体適合性を有し、GelMAとAlgMAを混合すると、複合バイオインクは効果的なせん断減粘挙動と温度依存の弾性率を維持し、急速に架橋することができます。細胞に優しい押し出し圧力で室温で直接印刷し、光架橋後の構造の安定した構造を維持します。さらに、ABLH は生体適合性が高く、OC 再生に適していますが、その中でも 7G3A はさらなる研究に最適な比率です。その上にはACPC（高さ3mm）、その下にはBMSC（高さ5mm）があります（図1）。

図1 複合バイオインクの調製と印刷可能性（2）ABLHのin vitro異種系統分化。ウサギの軟骨と骨髄からそれぞれ分離された軟骨前駆細胞（ACPC）と骨形成前駆細胞（BMSC）をin vitro単層培養で特性評価し、比較した。 2 つの細胞タイプは形態が似ていますが、BMSC は ACPC よりもクローン形成能力と増殖能力が強いです。その後、3Dバイオプリンティングを使用してACPCまたはBMSCを搭載したハイドロゲルが準備され、生理学的温度で印刷できるという利点により、バイオプリントされたハイドロゲルは内部の細胞の生存、増殖、拡散を促進しました。試験管内二重層モデルでは、ハイドロゲルの1つの層は細胞を含まない層であり、もう1つの層は細胞を包み込んでおり、ACPCとBMSCはそれぞれ7日と14日以内に拡散しました（図2）。

図 2 複合バイオプリントハイドロゲルは、埋め込まれた細胞の生存と増殖をサポートします。初期または後期段階での両細胞タイプの指向性分化の可能性をさらに評価するために、ACPC または BMSC を含むハイドロゲルを、それぞれ 7 日間または 14 日間の誘導期間中、軟骨形成培地または骨形成培地にさらしました。軟骨特異的遺伝子（Col2a1、Acan、Sox9）の発現レベルは、in vitro 分化中に徐々に増加しました。サフラニン O 染色では、ACPC を含むハイドロゲルで C-ECM が徐々に改善されていることが示され、免疫組織化学染色では、3D 培養プラットフォームで COLII と ACAN の発現が大幅に増加したことが明らかになりました。差次的に発現した遺伝子のヒートマップは、軟骨形成の正に制御された遺伝子の発現レベルが増加したが、負に制御された遺伝子の発現レベルは抑制されたことを示しました。詳細な経路解析により、活性化ミトコンドリア ATP 合成と酸化的リン酸化が ACPC の軟骨細胞系統への分化と関連していることが明らかになりました。 BMSC を充填したハイドロゲルでは骨特異的マーカーの発現レベルが上昇し、アリザリンレッド染色により O-ECM が徐々に増加していることが示されました。ヒートマップは、骨形成の正の制御遺伝子であるGli3、Ddr2、Bmp2/4/7 26の発現レベルが有意に増加し、負の制御遺伝子であるMdk、Hdac7、Grem1の発現が抑制されたことを示しました。さらに、BMSC が骨芽細胞系に分化する過程で概日シグナル伝達が観察されました。要約すると、ABLHは、in vitroでの3D培養において、それぞれACPCまたはBMSCの軟骨形成および骨形成の分化を促進した（図3）。

図 3 ACPC または BMSC を搭載したバイオプリント構造の軟骨形成または骨形成への影響 (3) ABLH は生体内で軟骨修復を促進します。軟骨または骨再生における ABLH の潜在的な治療効果を調査するために、ウサギの大腿骨の滑車溝に全層 OC 欠損モデルを作成しました。手術後 6 週間の肉眼的画像および組織形態計測画像によると、欠損群の軟骨修復は主に線維性結合組織で構成される C-ECM が乏しい表面でのみ発生していました。細胞を含まないハイドロゲルは、脆弱な軟骨結合と中空の骨構造を示しました。対照的に、3つの細胞を充填したハイドロゲルは、比較的完全なOCユニットを示し、軟骨マトリックスが豊富な領域を形成しました。ABLHは、軟骨と軟骨下骨の上にあるC-ECMの合成に寄与しました。さらに、手術から12週間後、欠損群の不完全なOCユニットを除いて、4つのハイドロゲル治療群の形態学的再構築が完了し、その中でBMSCハイドロゲルはACPCハイドロゲルよりも完全な軟骨下骨構造を示しました。ABLHの軟骨再生効率は、ACPCハイドロゲルよりも23.5％高かった。全体として、これらの知見は、ABLHが軟骨の修復と再生を促進することを示しています。

図4 ABLHは生体内で軟骨再生を促進する（4）ABLHは生体内で骨リモデリングを促進する ABLHの骨リモデリングに対する潜在的な治療効果を、マイクロコンピュータ断層撮影分析と組織学的観察によって詳細に調べた。移植後 6 週間で、無細胞ハイドロゲルは欠損群と比較して骨量の改善効果が限られており、機械的なサポートだけでは新しい骨の形成を促進するのに十分ではないことが示されました。ACPC ハイドロゲルは、表面に繊維組織のような接続を形成し、深層に嚢胞状の空洞を残す傾向があり、これにより下層の骨の再構築が促進されるだけでなく、上部の軟骨層の完全性が維持され、軟骨と骨の発達に適した環境が提供されます。成熟骨とCOLIの特異的染色により、デュアルセルハイドロゲルは極めて自然な微細構造を持つ生体模倣骨再生を達成し、骨構造の成熟度はBMSCを含むハイドロゲルよりも20.8%高いことが示されました（図5）。

図5 ABLHは生体内で軟骨下骨の形成とリモデリングを促進する（5）ABLHはOCユニットの再構築のために軟骨-骨-血管のクロストークを調整する体外軟骨形成プロセス中、ACPCを運ぶハイドロゲルの血管新生は徐々に弱まり、遺伝子セットエンリッチメント分析（GSEA）により血管新生の阻害効果がさらに確認された。遺伝子オントロジー（GO）に基づくヒートマップは、軟骨形成の初期段階で新しい血管が形成されたが、軟骨の成熟と分化が完了した後にこれらの血管の形成が大幅に減少したことを示しました。体外骨形成中、BMSC を運ぶハイドロゲルで血管新生が徐々に増加しました。GSEA 分析により、分化中に血管が徐々に形成されることが確認されました。GO 分析により、血管新生、リモデリング、および新しい血管の拡張が、骨形成中の骨マトリックスのリモデリングに不可欠であることが示されました。生体内実験では、免疫蛍光染色により、BMSC ハイドロゲルは骨形成を促進する傾向が強く、ACPC を含むハイドロゲルは軟骨形成を促進する傾向があることが示されました。変形性関節症が進行すると、軟骨下骨領域のH型血管が増加し、軟骨組織に侵入することもあります。H型血管の形成を阻害することで、軟骨代謝のバランスが整い、変形性関節症の症状が緩和されます。二細胞ハイドロゲルでは、H 型血管は骨層に閉じ込められ、軟骨を貫通して恒常性を乱すことなく、より調和のとれた軟骨と骨の界面を得るために重要です。結論として、ABLHは骨芽細胞と軟骨細胞の相互作用を再構成し、階層的なOCユニットの再構築を実現します（図6）。

図6 ABLHは軟骨-骨-血管のクロストークを調整してOCユニットを再構築する
要約する

この研究では、細胞の成長と分化の能力を維持しながら、室温で直接印刷できる細胞搭載型 ABLH を構築しました。体外 3D 培養システムでは、ACPC は軟骨細胞に分化し、BMSC は骨芽細胞に分化します。同所的に移植された ABLH は、生体内の OC 欠損モデルにおいて、上部軟骨細胞外マトリックス (C-ECM) とその下の骨細胞外マトリックス (O-ECM) の特異的な再構築を達成しました。機構的には、ABLH は軟骨、骨、血管の相互作用を時空間的に制御することにより、バイオニック OC ユニットのリモデリングを促進します。この研究では、生きた細胞を利用した二重層ハイドロゲル生体適応戦略を提案し、OC 欠陥の効率的な修復のための新しいアプローチを提供しました。

ソース：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10746383/

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