華南理工大学「バイオアクト・マター」：スキャフォールドの細孔形態が骨再生メカニズムを制御する

出典: EngineeringForLife

骨のバイオニクスと構造工学は、より良い骨の再生のために人工足場を最適化することへの幅広い関心を刺激してきました。しかし、スキャフォールドの細孔形態が骨再生を制御する仕組みは不明のままであり、骨修復のためのスキャフォールド構造の設計は困難を極めています。この問題に対処するため、華南理工大学の Kuang Yudi、Zhao Naru、Wang Yingjun らは、円筒形 (C)、らせん形 (G)、ダイヤモンド形 (D) という 3 つの代表的な細孔形態を持つ β-TCP スキャフォールドの骨形成特性を慎重に評価しました (図 1a)。結果は、D 型スキャフォールドが RhoA/ROCK2 経路の機械的シグナル伝達を強化することによって BM を促進することを示しました。
SC は骨形成細胞へと分化し、より多くの移動関連成長因子を分泌し、その結果、これらの足場における最適な骨再生がもたらされました (図 1 b)。この研究は、新しい生体適合性スキャフォールド設計の開発に向けて、気孔形態によって媒介される骨再生のメカニズムについての洞察を提供します。当該研究成果は、「3Dプリントされた細孔形態がRhoA/ROCK2シグナル伝達経路を介して骨髄幹細胞の挙動を媒介し、骨再生を促進する」というタイトルで、2023年3月20日に「Bioact. Mater.」に掲載されました。

図 1 異なる細孔形態を持つスキャフォールドスキームとスキャフォールド-BMSC 相互作用メカニズム: (A) 円筒形、らせん形、ダイヤモンド形の細孔形態を持つ 3D プリントされたスキャフォールド。(B) 細孔形態を介した細胞骨格力と BMSC の核変形は、RhoA/ROCK2 シグナル伝達経路を介して骨再生を促進します。

1. 異なる細孔形態を有するβ-TCPスキャフォールド上での骨髄間葉系幹細胞の挙動<br /> β-TCP スキャフォールドの 3 種類の細孔構造の作成に成功し (図 2a)、BMSC はスキャフォールド上で異なる広がり状態を示しました (図 2b)。細胞の伸張状態や伸長状態の違いが遺伝子発現に影響を与える可能性があるため、これらの足場上の BMSC は異なる細胞の挙動や運命を示す可能性があります。次に、図 2C に示すように、統合された経路 (各経路は細孔形態で構成されている) を備えたカスタマイズされたスキャフォールドを準備し、スキャフォールドの外側から内側への BMSC の移動挙動を評価しました。移行実験により、D および G スキャフォールドの方が骨再生を誘導する可能性が高いことが示されました (図 2D、E)。 CCK8検出の結果、Cスキャフォールド上のBMSCsの増殖は他のグループよりも有意に良好であることが示されました（図2F）。これは、多角形の展開状態によって引き起こされる内部応力の緩和に起因する可能性があります。アルカリホスファターゼ（ALP）活性（図2G）およびRT-qPCR（図2H）の結果によると、7日目には、DスキャフォールドグループのALP、Col-1、OCN、およびEngineeringForLifeの発現が最も高く、Cスキャフォールドグループの発現が最も低かったことがわかりました。上記の結果から、これらのスキャフォールドの中で、D スキャフォールドが BMSC の骨形成分化を誘導する上で最も優れた効果を発揮することが確認されました。さらに、BMSCからの血管新生因子の傍分泌に対する孔形態の影響を調査した（図2I）。血管新生試験では、Gスキャフォールド群のBMSC培養上清中のVEGFとAng-1の濃度が最も高く（図2J）、骨再生効果が優れていることが示されました（図2K、L）。

図2 異なるβ-tCPスキャフォールド上の骨髄間葉系幹細胞の細胞挙動

2. 骨髄間葉系幹細胞の細孔形態を介したシグナル伝達機構
RNA配列解析の結果、D群とG群の一部遺伝子の発現がC群と比較して上昇していることが示され（図3A）、BMSCがDスキャフォールド内で最も強い移動能力を持っていることが示唆されました。さらに、骨分化関連遺伝子（OCN3、BMP2、ALPK1など）および血管新生関連因子（VEGFA、PDGFC、PDGFAなど）も、Cスキャフォールドグループと比較して、GスキャフォールドグループとDスキャフォールドグループでアップレギュレーションされていました（図3B、C）。クラスター分析とヒートマップの樹形図は、RhoA/ROCK2シグナル伝達経路に関連する遺伝子（DVL2、DAAM1、RhoA、およびROCK2）の発現がCスキャフォールドグループよりもGスキャフォールドグループとDスキャフォールドグループで高いことを示した（図3D）。 RT-qPCR分析とウエスタンブロッティングでも、GスキャフォールドとDスキャフォールドにおけるRhoA/ROCK2シグナル伝達経路関連遺伝子とタンパク質の高発現が確認されました（図3E-L）。これらの結果は、BMSC が異なる細孔形態を持つ足場内で異なる細胞骨格の再編成と機械的ストレス伝達を受けることを明らかにしています。

図3 RNAシークエンシングとバイオインフォマティクス解析

次に、RhoA/ROCK2 阻害剤の有無にかかわらず、異なる足場上で培養された BMSC の骨形成分化および移動因子のレベルを調べました。細胞培養培地中にRhoA/ROCK2阻害剤が存在しない場合、RhoA、ROCK2、および活性化タンパク質（p-RhoA、p-ROCK2）のレベルは、CスキャフォールドグループよりもGスキャフォールドグループとDスキャフォールドグループの方が高かった（図4A-D）。 CDC42、OCN、Runx2のタンパク質発現レベルは、Dスキャフォールド > Gスキャフォールド > Cスキャフォールドの順でした。これらの結果は、RhoA/ROCK2 シグナル伝達経路が、BMSC の骨形成分化と移動を制御するために、足場孔形態刺激を伝達する上で重要な役割を果たしていることを示しています。図 4E は、スキャフォールドの細孔形態によって媒介される BMSC の挙動のメカニズムを示した図です。細孔形態は、RhoA/ROCK2 シグナル伝達経路を介して BMSC の骨形成分化と移動に影響を与えます。

図4 (AC) RhoA/ROCK2シグナル伝達経路に対する薬物介入。(D) ELISAを使用して、RhoAおよびRoCK2阻害剤の介入の7日前と介入後に、さまざまな孔形態における骨形成関連Runx2および移動関連CDC42タンパク質のレベルを検出しました。(E) メカニズムの要約：孔形態は、RhoA/ROCK2シグナル伝達経路を介してBMSCの骨形成分化および移動に影響します。

3. 異なる孔形状を持つスキャフォールドにおける生体内骨再生の評価<br /> 次に、大腿骨顆部欠損部を構築し、スキャフォールドの生体内骨再生効果を評価した（図5A）。骨梁カウント、マイクロCT、血管分布検出、およびヴァンギーソン染色（VG）の結果はすべて、GおよびDスキャフォールドの血管新生能力がCスキャフォールドよりも強く、骨再生を促進できることを示しました。

図5 ステント留置後4、8、12週後の大腿骨顆部欠損部の組織学的分析とマイクロCT検査

さらに、連続蛍光標識により2〜4週および6〜8週ですべてのスキャフォールドの動的骨形成を検出することにより、骨再生率を評価しました（図6）。欠損部の異なる領域における新生骨の成長をより正確に定量化するために、円柱状の欠損部を3つの部分（外層：0～1 mm、中層：1～2 mm、内層：2～3 mm）に分割した（図6a）。蛍光標識染色の結果、C-スキャフォールド群における新生骨沈着速度は外側から中央に向かって徐々に遅くなり、C-スキャフォールドの中央領域にはほとんど新生骨が見られなかったことが示された（図6B、C）。対照的に、D スキャフォールドと G スキャフォールドの中間層と中央層の骨沈着率は有意に高く、スキャフォールド内の細胞の移動率が異なっていたことを示しています。これらの結果は、生体内での新しい骨の成長において、足場の形態が重要な役割を果たすことを明らかにしています。

図6 骨形成の動的組織学的解析

要約すると、3 つの細孔構造を持つ β-TcP スキャフォールドの骨形成能が in vitro および in vivo で評価されました。 D スキャフォールドは、BMSC の接着状態に影響を与え、細胞の移動を促進し、BMSC の骨形成分化を促進することにより、RhoA/ROCK2 シグナル伝達経路をより高いレベルで活性化しました。同時に、D スキャフォールドと G スキャフォールドは、骨髄間葉系幹細胞の傍分泌に影響を及ぼすことで血管新生を促進することもできます。骨修復の生体内評価では、D スキャフォールドは G スキャフォールドや C スキャフォールドよりも骨修復を促進するのに優れた性能を示しました。この研究により、細孔の形態が細胞の挙動に影響を及ぼすメカニズムについての理解が深まります。

オリジナルリンク:
https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.02.025

華南理工大学「バイオアクト・マター」：スキャフォールドの細孔形態が骨再生メカニズムを制御する

劉景夢のインク：液体金属を「冷たい市場」から「熱い市場」に変える

珠海西通が北京でポイントスキャン3Dプリント（SLA）オペレーティングシステムを発表

電気自動車で環境を守りたいですか? 3Dプリントは試してみる価値があるかもしれない

魏旭剛：人類の製造業の短い歴史を語る4つの短編小説

ULの新しい調査で3Dプリンターの排出物の毒性が明らかに

Xact MetalとJoin3dがスペインとポルトガルの市場ニーズに応えるため販売提携を締結

IDCレポート、医療および航空宇宙分野における3Dプリント技術の現状

ASTMが金属積層造形に関する新しい規格を発表

10,000人以上のユーザーにサービスを提供するScantechは、3Dビジュアルデジタル化業界に深く関わっています。

3Dスキャン機器のリーダーである3DMakerproは、大規模プロジェクトのデータ収集用のEagleシリーズ機器を発売しました。

推薦する

中科宇辰の新しい5軸粉末供給3Dプリンターは、最大印刷サイズが1.5メートル、最大レーザー出力が10,000ワットです。

3Dプリント材料が砂に拡大、中国北西部で材料の研究開発を行う企業

3Dプリントされた椎骨が、30年間の頸椎症から男性を救う

米国の研究者が超弾性を持つ3Dプリント形状記憶合金を開発！

Vuzix と Materialise が提携し、医療から倉庫保管、物流まで幅広い用途に使える 3D プリントスマートグラスを開発

西安交通大学国立ラピッドマニュファクチャリング工学研究センター訪問

ユニバーサル社、Arcam社製の新型電子ビーム金属3Dプリンター10台を発注

北京石景山3Dプリント産業応用セミナーには数百人が参加した。現在のシステムは3Dプリントの医療への応用を深刻に妨げている。

お知らせ：3Dプリント医療機器グループ標準処方カテゴリ登録の第1バッチ

ポーランドの博物館が、驚くほどリアルな3Dプリントの魚の模型を発見

3D プリントの将来はどうなるのでしょうか?業界の先駆者3D Systemsがペレット押し出し3Dプリントに賭け、小型プリンターを発売

Microlight3DとEden Techがマイクロ流体分野で提携し、高精度のマイクロ流体設計ツールを提供

アストロアメリカ、軍事用途向けグアムAM産業の展開を加速

放射線医学における 3D プリントの 5 つの主要な臨床応用

3Dプリンティングが再びネイチャー誌で特集され、マルチマテリアルとマルチノズルプリンティング技術のブレークスルーが発表されました